第二節(jié)　發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)

一、發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的目的

不同微生物對培養(yǎng)基的需求是不同的，不同的發(fā)酵生產(chǎn)所需要的原料也不同。工業(yè)生產(chǎn)上選用的培養(yǎng)基，必須根據(jù)生產(chǎn)菌的營養(yǎng)特性和生產(chǎn)工藝的要求來進(jìn)行選擇。一個(gè)合適的培養(yǎng)基，應(yīng)該能夠充分滿足生產(chǎn)菌生長、代謝的需求，能達(dá)到高產(chǎn)、高質(zhì)、低成本的目的，其選擇的一般原則如下：

（1）能夠滿足生產(chǎn)菌的生長、代謝的需要　各種生產(chǎn)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的要求不盡相同，有共性，也有各自的特性，且每種生產(chǎn)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的要求在生長、繁殖階段與產(chǎn)物代謝階段有可能不同。實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)菌的營養(yǎng)特性、生產(chǎn)目的來考慮培養(yǎng)基的組成。

（2）目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量最高　氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)上，生產(chǎn)菌的氨基酸代謝量與培養(yǎng)基組成有較大關(guān)系。在滿足生產(chǎn)菌的生長、代謝需求的前提下，應(yīng)選擇能夠大量積累代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基，以達(dá)到產(chǎn)量最高的目的。

（3）產(chǎn)物得率最高　產(chǎn)物得率高低與生產(chǎn)菌株的性能、培養(yǎng)基的組成以及發(fā)酵條件有關(guān)，對于某一菌株在某種發(fā)酵條件下，培養(yǎng)基的選擇十分重要。底物能夠最大限度地轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物，有利于降低培養(yǎng)基成本。

（4）生長菌生長及代謝迅速　保證微生物在所選的培養(yǎng)基上生長、代謝迅速，能夠在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到發(fā)酵工藝要求的菌體濃度，并能在較短時(shí)間內(nèi)大量積累代謝產(chǎn)物，可有效地縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備的周轉(zhuǎn)率，提高產(chǎn)能。

（5）減少代謝副產(chǎn)物生成　培養(yǎng)基選擇適當(dāng)，有利于減少代謝副產(chǎn)物的生成。代謝副產(chǎn)物生成量最小，可最大限度地避免培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的浪費(fèi)，并使發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的純度相對提高，對產(chǎn)物的提取操作和產(chǎn)品的純度有利，同時(shí)可降低發(fā)酵成本和提取成本。

（6）廉價(jià)并具有穩(wěn)定的質(zhì)量　選擇價(jià)格低廉的培養(yǎng)基原料，有利于降低發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基成本。同時(shí)，也應(yīng)要求培養(yǎng)基原料的質(zhì)量穩(wěn)定。因?yàn)楣I(yè)規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中，培養(yǎng)基原料質(zhì)量的穩(wěn)定性是影響生產(chǎn)技術(shù)指標(biāo)穩(wěn)定性的重大因素之一。特別是對于一些營養(yǎng)缺陷型菌株，培養(yǎng)基原料的組分、含量直接影響到菌體的生長，若原料質(zhì)量經(jīng)常波動(dòng)，則發(fā)酵條件較難確定。

（7）來源廣泛且供應(yīng)充足　培養(yǎng)基原料一般采用來源廣泛的物質(zhì)，并且根據(jù)工廠所在的地理位置，選擇當(dāng)?shù)鼗蛘吒浇赜蛸Y源豐富的原料，最好是一年四季都有供應(yīng)的原料。一方面，可保證生產(chǎn)原料的正常供應(yīng)，另一方面可降低采購、運(yùn)輸成本。

（8）有利于發(fā)酵過程的溶解氧及攪拌　氨基酸發(fā)酵是好氧發(fā)酵，主要采用液體深層培養(yǎng)方式，在發(fā)酵過程中需要不斷通氣和攪拌，以供給微生物生長、代謝所需的溶解氧。培養(yǎng)基的黏度等直接影響到氧在培養(yǎng)基中的傳遞以及微生物細(xì)胞對氧的利用，從而會(huì)影響發(fā)酵產(chǎn)率。因此，選擇培養(yǎng)基還應(yīng)考慮這方面的因素。

（9）有利于產(chǎn)物的提取及純化　培養(yǎng)基雜質(zhì)過多或存在某些對產(chǎn)物提取具有干擾的成分，不利于提取操作，使提取步驟復(fù)雜，導(dǎo)致提取率低、提取成本高、產(chǎn)物純度低等。因此，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，也要考慮發(fā)酵后是否有利于產(chǎn)物的提取。

（10）廢物的綜合利用性強(qiáng)，且處理容易　提取產(chǎn)物后的廢液是否可以綜合利用，廢液綜合利用的程度直接影響到環(huán)境的保護(hù)。考慮到環(huán)保因素，選擇適合的培養(yǎng)基，使提取廢液的綜合利用變得容易，不但可以減輕廢物處理的負(fù)荷，降低廢物處理的運(yùn)行費(fèi)用，而且副產(chǎn)品可以產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益，對降低整個(gè)生產(chǎn)成本十分有益。

二、發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的基本原則

1.根據(jù)生產(chǎn)菌株的營養(yǎng)特性配制培養(yǎng)基

首先要了解生產(chǎn)菌株的生理生化特性和對營養(yǎng)的需求，還要考慮產(chǎn)物的合成途徑和產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)等方面，設(shè)計(jì)一種既有利于菌體生長又有利于代謝產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基。

2.營養(yǎng)成分的配比恰當(dāng)

無論是菌體生長還是代謝產(chǎn)物形成，營養(yǎng)物質(zhì)之間都應(yīng)有合適的配比。濃度太低，則不能滿足微生物生長的需要，濃度太高，又會(huì)抑制微生物的生長。一般情況下，用于培養(yǎng)菌體的種子培養(yǎng)基營養(yǎng)成分應(yīng)豐富，尤其是氮源含量宜高，即C/N值低。相反，用于積累大量生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基，它的氮源一般應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低，即C/N值高。當(dāng)然，若發(fā)酵產(chǎn)物是含氮化合物時(shí)，有時(shí)還應(yīng)該提高培養(yǎng)基的氮源含量。

在設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時(shí)，還應(yīng)特別考慮到代謝產(chǎn)物是初級代謝產(chǎn)物，還是次級代謝產(chǎn)物。若是次級代謝產(chǎn)物，還要考慮是否加入特殊元素（如維生素B₁₂中的Co）或特定的前體物質(zhì)（如生產(chǎn)青霉素時(shí)，應(yīng)加入苯乙酸或苯乙酰胺等前體物質(zhì)）。

在設(shè)計(jì)培養(yǎng)基尤其是大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)用的培養(yǎng)基時(shí)，還應(yīng)重視培養(yǎng)基中各種成分的來源和價(jià)格，應(yīng)該優(yōu)先選擇來源廣泛、價(jià)格低廉的培養(yǎng)基，提倡“以粗代精”“以廢代好”。因此，應(yīng)針對不同菌株、不同時(shí)期的營養(yǎng)需求對培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行配比。

3.滲透壓

對生產(chǎn)菌株來說，培養(yǎng)基中任何營養(yǎng)物質(zhì)都有一個(gè)適合的濃度。從提高發(fā)酵罐單位容積的產(chǎn)量來說，應(yīng)盡可能提高底物濃度，但底物濃度太高，會(huì)造成培養(yǎng)基的滲透壓太大，從而抑制微生物的生長，反而對產(chǎn)物代謝不利。例如，在谷氨酸發(fā)酵中，葡萄糖濃度超過200g/L時(shí)，菌體生長明顯緩慢。但營養(yǎng)物質(zhì)濃度太低，有可能不能滿足菌體生長、代謝的需求，發(fā)酵設(shè)備的利用效率不高。為了避免培養(yǎng)基初始滲透壓過高，又要獲得發(fā)酵單位容積內(nèi)的高產(chǎn)量，目前傾向于采用補(bǔ)料發(fā)酵工藝，即培養(yǎng)基底物的初始濃度適中，然后在發(fā)酵過程中通過流加高濃度營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)充。

在設(shè)計(jì)營養(yǎng)物配比時(shí)，還應(yīng)該考慮避免培養(yǎng)基中各成分之間的相互作用。如蛋白胨、酵母膏中含有磷酸鹽時(shí)，會(huì)與培養(yǎng)基中的鈣離子或鎂離子在加熱時(shí)發(fā)生沉淀反應(yīng)。在高溫下，還原糖與蛋白質(zhì)或氨基酸也會(huì)相互作用，產(chǎn)生褐色物質(zhì)。

4.適宜的pH值

各生產(chǎn)菌株都有其生長最適pH值和產(chǎn)物合成最適pH值，為了滿足微生物的生長和代謝的需要，培養(yǎng)基配制和發(fā)酵過程中應(yīng)及時(shí)調(diào)節(jié)pH值，使之處于最適pH值范圍。這是因?yàn)槲⑸镌谏L代謝過程中營養(yǎng)物質(zhì)的利用和代謝產(chǎn)物的形成往往會(huì)改變環(huán)境中的pH值。例如，培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)或氨基酸經(jīng)發(fā)酵后，會(huì)產(chǎn)生氨，從而有升高培養(yǎng)基pH值的趨勢。培養(yǎng)基的滅菌過程也會(huì)引起培養(yǎng)基的pH值發(fā)生變化。高溫處理過程中，一些大分子發(fā)生分解，造成pH值下降。部分微生物生長的最適pH值，見表3-8。

三、發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的方法

培養(yǎng)基的組成必須滿足菌體細(xì)胞生長繁殖和產(chǎn)物合成代謝的元素需求，要提供維持細(xì)胞生命活動(dòng)和產(chǎn)物合成代謝所需要的能量。在設(shè)計(jì)各種培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基）時(shí)，要充分考慮細(xì)胞的元素組成狀況。在實(shí)驗(yàn)分析某些細(xì)菌細(xì)胞的元素組成與培養(yǎng)基中一些元素濃度的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中某些元素如P、K等是超量的，某些元素Zn、Cu等接近最大需求量，P濃度的變化使許多培養(yǎng)液緩沖能力發(fā)生變化。細(xì)菌、酵母菌和霉菌細(xì)胞的元素組成（干重）見表3-9。

對于微生物生長后期能合成某種或某些代謝產(chǎn)物的發(fā)酵來說，設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基不僅要考慮細(xì)胞組成所需要的元素，而且還要認(rèn)真分析組成代謝產(chǎn)物的元素種類和數(shù)量，同時(shí)分析何種營養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物合成有內(nèi)在聯(lián)系。一般來說，設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基應(yīng)具備這樣的效果：菌體對數(shù)生長期開始時(shí)，有生理功能的菌體迅速生長繁殖，對數(shù)生長期末能迅速轉(zhuǎn)入代謝產(chǎn)物合成的生產(chǎn)期，并使產(chǎn)物合成速率保持一適宜的線性關(guān)系，此種線性關(guān)系能維持相當(dāng)長時(shí)間，可獲得最大的產(chǎn)物合成量。

確定一種適合于工業(yè)生產(chǎn)的孢子培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基等，僅僅按照微生物細(xì)胞營養(yǎng)元素理論值的條件還不能進(jìn)行培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)，因?yàn)槲⑸锏钠废挡煌渖硖禺愋圆町愝^大，產(chǎn)物的合成代謝途徑比較復(fù)雜，所以還必須對微生物種類、生理特性、一般營養(yǎng)需求、產(chǎn)物的組成和生物合成途徑、產(chǎn)品的質(zhì)量要求等進(jìn)行深入分析。同時(shí)，也要考慮所采用的發(fā)酵設(shè)備和培養(yǎng)條件、原材料的來源等。上述工作完成后才能進(jìn)行基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成的設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成要經(jīng)過一定時(shí)間的搖瓶實(shí)驗(yàn)考察，根據(jù)菌種的生長動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)以及兩者的內(nèi)在聯(lián)系及其與環(huán)境條件的關(guān)系，進(jìn)一步修改其組成，使之適合菌體生長和產(chǎn)物合成的要求。

培養(yǎng)基的基本組成確認(rèn)后，還要進(jìn)一步考察所選用的原材料的配比關(guān)系，發(fā)酵培養(yǎng)基的各種原材料濃度配比恰當(dāng)，既利于菌體的生長，又能充分發(fā)揮菌體合成代謝產(chǎn)物的潛力。如果各種營養(yǎng)物質(zhì)配比失調(diào)，就會(huì)影響發(fā)酵水平。其中碳源與氮源的比例影響最為顯著，碳氮比偏小，能導(dǎo)致菌體的旺盛生長而造成菌體提前衰老自溶，影響產(chǎn)物的積累；碳氮比過大，菌體繁殖數(shù)量少，不利于產(chǎn)物的積累；碳氮比合適，而碳源、氮源濃度過高，仍能導(dǎo)致菌體的大量繁殖，增大發(fā)酵液黏度，影響溶解氧濃度，容易引起菌體的代謝異樣，影響產(chǎn)物合成；碳氮比合適，但碳源、氮源濃度過低，會(huì)影響菌體的繁殖，同樣不利于產(chǎn)物的積累。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮比是一個(gè)重要的控制指標(biāo)。另外，生理酸性物質(zhì)和生理堿性物質(zhì)的用量也要適當(dāng)，否則會(huì)引起發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH值大幅度波動(dòng)，影響菌體生長和產(chǎn)物合成。無機(jī)鹽的濃度不合適也會(huì)影響菌體生長和產(chǎn)物合成。

四、發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計(jì)算某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗(yàn)配方，再結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)方法篩選出較為合適的培養(yǎng)基。在篩選培養(yǎng)基中使用的原材料種類和濃度配比時(shí)，經(jīng)常采用的方法有單因子實(shí)驗(yàn)法、正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析等等。

一般培養(yǎng)基設(shè)計(jì)要經(jīng)過以下幾個(gè)步驟：

①根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)和培養(yǎng)要求，初步確定可能的培養(yǎng)基組分用量。

②通過單因子實(shí)驗(yàn)最終確定最為適合的培養(yǎng)基組分。

③當(dāng)確定培養(yǎng)基成分后，再以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定各成分最適合的濃度。

1.單因子實(shí)驗(yàn)

單因子實(shí)驗(yàn)是傳統(tǒng)的有效方法，適用于培養(yǎng)基組成和單一營養(yǎng)成分的選擇。在確認(rèn)培養(yǎng)基基本組成之后，逐個(gè)改變某一種營養(yǎng)成分的品種或濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分析比較實(shí)驗(yàn)所得的菌種生長情況、碳氮代謝規(guī)律、pH值變化情況、產(chǎn)物合成速率等結(jié)果，從中確定應(yīng)采用的原材料品種或配比濃度。單因子實(shí)驗(yàn)法在考察較少因素影響時(shí)經(jīng)常被采用，此法消耗大量的人力、物力和時(shí)間，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性不同。

2.正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是根據(jù)正交性準(zhǔn)則來選擇有代表性的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，這些實(shí)驗(yàn)點(diǎn)具備“均勻分散，整齊可比”的特點(diǎn)，有效地解決了實(shí)驗(yàn)因素較多而產(chǎn)生的多因素完全實(shí)施方案過大的矛盾，具體實(shí)驗(yàn)實(shí)施時(shí)采用規(guī)格化的正交表來安排多因素實(shí)驗(yàn)，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，找出最優(yōu)實(shí)驗(yàn)方案，廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以達(dá)到省時(shí)、省力、省錢的效果，同時(shí)又能保證得到基本滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.均勻設(shè)計(jì)

均勻設(shè)計(jì)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相比，只考慮實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)“均勻分散”，而不要求“整齊可比”，也是通過一套精心設(shè)計(jì)的均勻設(shè)計(jì)表來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析一般采用非線性的二次響應(yīng)曲面回歸分析，可考察各因素的重要程度和因素間的交互作用。如果符合線性回歸條件，也可采用多重線性回歸分析。回歸分析，不但可以篩選自變量，還可以根據(jù)回歸方程找出“最佳組合”，但要注意回歸方程的不可外延性。

4.響應(yīng)面分析

（1）Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法是主要針對因子數(shù)較多，且未確定眾因子相對于響應(yīng)變量的顯著性而采用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可以分清實(shí)驗(yàn)因素對指標(biāo)影響的大小，找出主要因素，抓住主要矛盾。用此方法可以使實(shí)驗(yàn)次數(shù)減少，而影響因素的主要效果得到盡可能準(zhǔn)確的估計(jì)，能從眾多的考察因素中盡快而有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素，以便后面進(jìn)一步研究。

（2）根據(jù)Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)找出顯著因素后，安排最陡爬坡試驗(yàn)，要先逼近最佳區(qū)域后再建立有效的響應(yīng)面擬合方程。最陡爬坡法試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳區(qū)域。可以了解實(shí)驗(yàn)因素與實(shí)驗(yàn)指標(biāo)影響的規(guī)律性，即每個(gè)因素的水平改變時(shí)，指標(biāo)是怎樣變化的。

（3）Box-Benhnken Design（BBD）法是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次方程來擬合因素和響應(yīng)面值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)提取條件，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。與其他方法相比，BBD實(shí)驗(yàn)減少了實(shí)驗(yàn)次數(shù)，周期短，得到的回歸方程精確度高，又能研究好幾個(gè)因素之間的交互作用，是解決生產(chǎn)過程中實(shí)際問題的一種有效辦法。