第一節　發酵工業原料

一、發酵工業原料選擇的依據

發酵原料的營養成分對微生物的生長、繁殖及代謝的影響極大。微生物生長、繁殖以及代謝的要求不同，其發酵原料成分和含量的要求也存在差異。因此，原料的種類很多，但無論哪種原料，都應滿足微生物生長、繁殖和代謝方面所需要的各種營養物質，如碳源、氮源、無機鹽、生長因子和水。從工藝角度來看，凡是能被生物細胞利用并轉化成所需的代謝產物或菌體的物料，都可作為發酵工業生產的原料。例如選擇淀粉質原料生產酒精時，從工藝的角度著眼，任何含有可發酵性糖或可變為發酵性糖的原料，都可作為酒精生產的原料。

對于工業上大規模投入生產的原料，除了要提出工藝上的要求外，還要提出生產管理和經濟上的要求，因此，在選擇工業上大規模生產酒精的原料時，應考慮下列條件：

（1）因地制宜，就地取材，原料產地離工廠要近，便于運輸，節省費用。

（2）營養物質的組成比較豐富，濃度恰當，能滿足菌種發育和生長繁殖成大量有生理功能菌絲體的需要，更重要的是能顯示出產物合成的潛力。

（3）原料資源要豐富，容易收集。由于酒精生產需要大量原料，要保證一定的庫存量。

（4）原料要容易貯藏　應考慮到新鮮原料內含水量多，不耐久藏，最好選擇經干燥后含水極少的干原料，易于保藏，不易腐爛。

（5）在一定條件下，所采用的各種成分（生產上常稱為原材料）彼此之間不能發生化學反應，理化性質相對穩定。

（6）生產過程中，既不影響通氣與攪拌的效果，又不影響產物的分離精制和廢物處理。

（7）對人類的身體無損害，影響發酵過程的雜質含量應當極少，或者幾乎不含。

（8）原料價格低廉，可降低產品成本。

此外，還應當考慮大力節約糧食原料，盡量少用或不用糧食原料，充分利用當地的非糧食原料，廣泛利用野生植物原料，同時利用農林副產物和植物纖維原料，以及亞硫酸鹽紙漿廢液等，這對于節約糧食原料有著重要意義。

二、培養基的營養成分

工業微生物絕大部分都是異養型微生物，它需要糖類、蛋白質和前體等物質提供能量。

（一）基本營養源

基本營養源主要為微生物提供生長相應的營養條件，包括碳源、氮源、無機鹽、生長因子和水分等。

1.碳源

凡是能為微生物的生長和代謝提供碳來源的物質統稱為碳源。因為微生物細胞的原生質體（細胞內碳架結構）以及幾乎所有的代謝產物都是含有碳的有機物質，碳源是微生物細胞壁、莢膜和細胞貯藏物質的主要構成成分，且絕大多數微生物的碳源可以兼作能源。因此，碳源主要用來供給菌種生命活動所需的能量和構成菌體細胞以及代謝產物的物質基礎。

常用的碳源物質有葡萄糖、蔗糖、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜及纖維素等。

（1）純糖原料　葡萄糖是碳源中最易利用的糖，它是由淀粉加工制備的，其產品有固體粉狀葡萄糖和葡萄糖漿（含有少量的雙糖）。幾乎所有微生物都能利用葡萄糖，所以葡萄糖常作為培養基的一種主要成分，廣泛運用于抗生素、氨基酸、有機酸、多糖、黃原膠等發酵生產中。但是過多的葡萄糖會過分加速菌體的呼吸，以致培養基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間產物不能完全氧化而積累在菌體或培養基中（如丙酮酸、乳酸、乙酸等），導致pH值下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長和產物的合成。

工業發酵中使用的蔗糖和乳糖既有純制產品，又有含此兩種糖的糖蜜和乳清，麥芽糖多用于制糖漿。它們主要用于抗生素、氨基酸、有機酸、酶類的發酵。

（2）淀粉質原料　淀粉為白色無定形的結晶粉末，存在于各種植物組織中。在顯微鏡下觀察，發現淀粉有圓形、橢圓形和多角形三種形狀。淀粉的分子單位是葡萄糖，由許多葡萄糖脫水縮聚而成，其分子式可用（C₆H₁₀O₅）_n表示。淀粉一般有直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種。直鏈淀粉由不分支的葡萄糖鏈構成，葡萄糖分子間以α-1，4-糖苷鍵聚合而成，聚合度一般為100～6000。支鏈淀粉的直鏈由葡萄糖分子以α-1，4-糖苷鍵相連接，而支鏈與直鏈葡萄糖分子以α-1，6-糖苷鍵相連接，它的分子呈樹枝狀，形成分支結構。支鏈淀粉分子較大，聚合度為1×10³～3×10⁶，一般在6000以上。

發酵生產的淀粉質原料，一般可分成幾類，見表3-1。

（3）糖蜜原料　糖蜜是甘蔗或甜菜糖廠的一種副產物，又稱橘水。糖蜜含糖量很高，這些糖分就目前制糖工業技術水平已不能或不宜用結晶方法進行回收。糖蜜是一種非結晶糖分，因其本身就含有相當數量的可發酵性糖，無須糖化。因此，糖蜜是微生物工業大規模發酵生產酒精、甘油、丙酮、丁醇、檸檬酸、谷氨酸、食用酵母及液態飼料等的良好原料。

糖蜜可分為甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。甘蔗糖蜜是以甘蔗為原料的糖廠的一種副產物。我國南方各省位于亞熱帶，氣候溫和，適于種植甘蔗，如廣東、廣西、福建、四川和臺灣等地均盛產甘蔗，甘蔗糖蜜的產量為原料甘蔗的2.5%～3%。甘蔗糖蜜中含有30%～36%的蔗糖與20%的轉化糖。甜菜的種植以東北、西北、華北等地區為主，甜菜糖蜜為甜菜糖廠的一種副產物，它的產量為甜菜的3%～4%。 糖蜜中干物質的濃度很大，在80～90°Bx，含50%以上糖分、5%～12%的膠體物質以及10%～12%的灰分，如果不進行預處理，則微生物無法生長和發酵，故糖蜜發酵前的處理非常重要。

（4）纖維素原料　發酵工業是用糧最多的產業部門，每生產1t酒精，耗糧3t左右，每生產1t有機酸，耗糧3～8t，抗生素、酶制劑等用糧量尤其大，全世界微生物工業消耗的糧食原料數量是十分驚人的。隨著微生物工業的日益發展，面臨著原料供應不足的問題，人們迫切需要開辟新的原料途徑，如利用纖維素、石油等。雖然石油代糧發酵研究已取得大量可轉化為生產的成果，但是由于石油儲量和開采量的限制，特別是石油消耗加速而導致石油價格持續攀升，嚴重阻礙了石油代糧發酵的產業化步伐。因此，人們不得不重新尋找新的代糧發酵原料。

目前，纖維素成為最現實可行的天然資源。因為它是自然界最豐富的可再生資源，每年通過光合作用合成1×10¹²t以上，這是世界糧食產量的幾百倍。所以，開發纖維素代糧發酵的前景廣闊，特別是20世紀80年代后，隨著各國對環境問題的關注而更傾向于開發利用能夠生物降解、環境協調良好且取之不盡、用之不竭的天然原料——纖維素。

纖維素是一種復雜的、天然的高分子多糖化合物，分子結構與淀粉相似，是由D-吡喃葡萄糖環經β-1，4-糖苷鍵組成的直鏈多糖，來源于棉花、木材、麻類、草類、某些海洋生物的外殼及各種農產品，其基本的結構單位是纖維二糖。纖維素的分子量可達幾十萬，甚至幾百萬，水解纖維素可得到葡萄糖。

木質纖維素的主要來源是農作物秸稈，是世界上最豐富的物質之一，全世界每年秸稈產量約為29億噸。木質纖維素除纖維素外，還包括半纖維素和木質素。半纖維素是一大類結構不同的多聚糖的統稱；木質素是一種高分子芳香族化合物，不能水解成糖，但可用作燃料。

酶解成本較高是纖維素代糧發酵的主要障礙，美國已投入上千萬美元進行降低纖維素酶解成本的研究，一旦纖維素酶解成本降低到可經濟生產，開發利用纖維素就進入產業化的實質階段。由于酶解后的單糖非常容易被多種生物利用，所以可進行多種發酵產品的開發應用。

（5）其他碳源　乙醇、甘露醇和甘油可作為微生物的碳源和能源。除乙酸已用作微生物的培養基外，其他有機酸比糖類較難被微生物吸收，作為碳源的效果不如糖類。脂類物質更難被微生物作為碳源利用，但并不是不能利用，低濃度的高級脂肪酸還可刺激某些細菌的生長。少數自養型微生物以CO₂或碳酸鹽作為唯一或主要的碳源，因為這兩者為碳的最高氧化形式，必須經過預還原才能轉化為細胞有機物質的碳架，這個過程需要能量。大多數需要有機碳源的微生物（指異氧型）也需要CO₂，因為有些生物合成反應（如丙酮酸的羧化和脂肪酸的合成）需要CO₂，只是需要量較少而已。雖然這些生物合成反應所需的CO₂可以從有機碳源和能源的代謝中獲取，但如果完全排除CO₂，往往會推遲或阻止微生物在有機培養基中的生長。少數細菌和真菌需要環境中含有較多的CO₂（5%～10%）才能在有機培養基中生長。

2.氮源

凡是能為微生物的生長和代謝提供氮來源的物質統稱為氮源，氮是組成微生物細胞的第二大要素。氮源主要用來構成菌體細胞物質和代謝產物，即蛋白質及氨基酸之類的含氮代謝物。一般來說，一個細菌細胞中氮元素的含量約占細胞干重的12%。

發酵工業生產中的氮源有以下幾種：

無機氮源：氨水、硫酸銨、尿素、硝酸鈉、硝酸銨、磷酸氫二銨等。無機氮源的利用速度一般比有機氮源快，因此無機氮源又被稱作速效氮源。

有機氮源：利用緩慢，包括蛋白胨、牛肉膏、花生餅粉、黃豆餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、酵母粉、麩皮水解液、魚粉、蠶蛹粉、發酵菌絲體和酒糟等。工業上常用的有機氮源及含氮量見表3-2。

（1）玉米漿　是一種用亞硫酸浸泡玉米而得的浸泡水濃縮物，含豐富的氨基酸、核酸、維生素、無機鹽等，它的平均化學組成見表3-3。

（2）黃豆餅粉　水分11%，總氮11.2%，類脂物0.6%，總糖30%，灰分6.5%。

（3）麩皮水解液　可以代替玉米漿，但蛋白質、氨基酸等營養成分比玉米漿少。

（4）尿素　菌體必須含脲酶方可使用。

（5）氨水　是一種無機氮源，目前常在生產中使用高濃度液氨，因分解，容易帶來pH波動的問題。

天然原料中的有機氮源由于產地不同，加工方法不同，其質量不穩定，常引起發酵水平波動。因此，在選擇有機氮源時要注意品種、產地、加工方法、貯藏條件對發酵的影響。凡能利用無機氮源的微生物，一般也能利用有機氮源，但有些微生物在只含無機氮源的培養基中不能繁殖，因為它們沒有將無機氮化合物轉化為有機氮化合物的能力。在發酵工業上，常常需要注意氮源與菌體生長和代謝產物合成的相關性。

3.無機鹽

無機鹽類是微生物生命活動所不可缺少的物質，其主要功能是構成菌體的成分，作為酶的組成部分或維持酶的活性，調節滲透壓、pH 值、氧化還原電位等。無機鹽類中的元素可分為主要元素和微量元素兩大類，主要元素有P、S、Mg、K、Ca等，微量元素有Fe、Cu、Zn、Mn等。在制備培養基時，通常加入K₂HPO₄（或KH₂PO₄）、MgSO₄就可滿足制備條件，但是菌種不同，需要的各種無機鹽類和微量元素的濃度也不同，必須根據具體情況予以控制。

4.生長因子

生長因子一般指微生物生長所不可缺少的，能調節微生物的代謝活動，不能從一般的碳源和氮源物質合成，必須另外添加的微量有機物，一般指B族維生素，也有氨基酸、嘌呤和嘧啶。

在微生物的科研和生產中，酵母膏、玉米漿、肝臟浸出液等，通常被作為生長因子的來源物質。事實上，許多作為碳源和氮源的天然成分，如麥芽汁、牛肉膏、麩皮、米糠、土豆汁等本身就含有極為豐富的生長因子，一般在這類培養基中，無須再另外添加生長因子。

5.水分

水既是微生物細胞的重要組成成分，占細胞總量的80%～90%，又是微生物體內和體外的溶劑，營養物質只有溶解于水才能被細胞吸收；同時，一定量的水分是維持細胞滲透壓的必要條件，代謝產物也只有通過水才能排出菌體外。由于水的比熱容高，因此水又是熱的良導體，能夠有效調節細胞的溫度。

（二）前體、促進劑和抑制劑

發酵培養基中某些成分的加入有助于調節產物的形成，并不促進微生物的生長，這些添加的物質包括前體、抑制劑和促進劑（包括誘導劑、生長因子）等。

1.前體

前體指某些化合物加入到發酵培養基中，能直接被微生物在生物合成過程中結合到產物分子上，而其自身的結構并沒有多大變化，但是產物的產量卻因加入前體而有較大的提高。前體最早是從青霉素的生產中發現的，在青霉素生產中，人們發現加入玉米漿后，青霉素產量可大大提高，進一步研究后發現發酵單位增長的主要原因是玉米漿中含有苯乙胺，它被優先結合到青霉素分子中去，從而提高了青霉素的產量。

2.促進劑和抑制劑

促進劑和抑制劑是指通過促進或抑制某一反應的發生來調節微生物的代謝，使生化反應集中在目標產物的形成上，從而提高產品的產量和質量的物質，前者稱為促進劑，后者稱為抑制劑。例如加巴比妥鹽能使利福霉素的發酵單位增加等。

在發酵過程中除了要加入上述物質外，有時還要加入消泡劑、表面活性劑等物質，以提高發酵罐的裝料量和使產物析出。

三、常用發酵原料的化學組成

發酵原料所含的化學成分，不僅關系著生產率的高低，同時也影響生產的工藝過程。常用原料中主要的化學成分見表3-4～表3-6。

1.糖類

原料中所含的淀粉，或與淀粉類似的菊糖、蔗糖、麥芽糖、果糖及葡萄糖等，都可以發酵生成產品，同時也是霉菌和酵母的營養及能源，原料中含這些物質越多，生成的酒精也就越多，所以它和產量有著密切的關系。糖類中的五碳糖多存在于原料的皮層，如麩皮、高粱糠、谷糠、花生殼等，它不但影響淀粉含量，發酵中也易生成有害的糠醛。纖維素雖屬于糖類，但不被淀粉水解，只起填充作用，對于發酵沒有直接影響。

2.蛋白質

原料含有的蛋白質，在發酵生產過程中，經蛋白酶水解后，可作為微生物生長繁殖的重要營養成分，而微生物細胞中，30%～50%（干重）是蛋白質。一般來說，當培養基內氮的含量適當，則微生物生長旺盛，酶的含量也較高。有些原料所含蛋白質有時不能滿足微生物生長和繁殖的要求，則應從外界加入氮源。氮源一般包括有機氮源和無機氮源兩種，根據不同情況，添加不同種類的氮源。

3.脂肪

脂肪對發酵有影響，如高粱糠、米糠等含油脂多，則產酸較快，產酸幅度也較大。一些發酵工廠如采用玉米作為原料，需要把玉米胚芽除去。

4.灰分

灰分中的磷、硫、鎂、鉀、鈣等是構成菌體細胞和輔酶的重要成分。另外，灰分還有調節培養基滲透壓的作用，是微生物生長不可缺少的。在一般原料中，灰分的含量通常足夠。

四、培養基的類型

在微生物發酵工業中，培養基是決定發酵生產效率的關鍵因素之一，培養基的成分和配比合適與否對生長菌的生長繁殖、代謝產物的發酵提取工藝及最終產品的產量和質量都產生相當大的影響。良好的培養基能充分發揮生產菌種的生物合成能力，與有效的培養條件相配合就可達到最大的生產效率。因此，在發酵工業中，培養基的組成是決定生產成本的關鍵因素，合理配比對發酵生產具有重要意義。

1.根據營養物質的不同來源

（1）天然培養基　是用各種植物和動物組織或微生物的浸出物、水解液等物質（如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、米曲汁、蛋白胨等）以及天然的含有豐富營養的有機物質（如馬鈴薯、玉米粉、麩皮、花生餅粉等）制成的培養基。天然培養基在發酵工業中普遍使用，優點是配制方便、經濟、營養豐富，適合于微生物生長。但是，它的化學成分不清楚或不穩定（受產地、品種、保存加工方法等因素影響）。

（2）合成培養基　使用成分完全了解的化學藥品配制而成的培養基稱為合成培養基。合成培養基的特點是化學成分明確、穩定，重復性好，但價格較貴，培養的微生物生長較慢。合成培養基適用于實驗室進行微生物生理、遺傳育種及高產菌種性能的研究；在生產某些疫苗過程中，為防止異性蛋白等雜質混入，也經常使用。培養放線菌的高氏一號培養基和培養真菌的察氏培養基都屬于合成培養基。

（3）半合成培養基　以天然的有機物作為碳源、氮源及生長因子的來源，并適當加入一些化學藥品以補充無機鹽成分，使其更能充分滿足微生物對營養的需求。例如，培養真菌用的馬鈴薯蔗糖培養基等。此類培養基的特點是配制方便、成本低、微生物生長良好、應用很廣，大多數微生物都能在此類培養基上生長。發酵生產和實驗室中應用的大多數培養基都屬于半合成培養基。

2.根據培養基的用途

（1）基礎培養基　基礎培養基又稱最低限度培養基，指能滿足某菌種的野生型（原養型）菌株最低營養要求的合成培養基。不同微生物的基礎培養基不相同，有的極為簡單，如大腸桿菌的基本培養基；有的極為復雜，如一些乳酸菌、酵母菌或梭菌的基本培養基。基本培養基有時也需要添加生長因子等。

若在基礎培養基中加入富含氨基酸、維生素、堿基等生長因子的營養物質，如蛋白胨、酵母膏等，就可滿足各種營養缺陷型菌株的生長需求，這種培養基稱為完全培養基。若在基礎培養基中只是針對性地加入一種或幾種營養成分，以滿足相應的營養缺陷型菌株生長，那么，這種培養基稱為補充培養基。

（2）增殖培養基　增殖培養基又名富集培養基。富集培養基是在普通培養基中加入血液、動（植）物組織液或其他營養物（或生長因子）的一類營養豐富的培養基。它主要用于培養某種或某類營養要求苛刻的異養型微生物，或者用來選擇性培養（分離、篩選、富集）某種微生物。增殖培養基具有助長某種微生物的生長，抑制其他微生物生長的功能。廣義上講，保藏培養基和鑒別培養基也屬于富集培養基。

（3）鑒別培養基　在培養基中添加某種或某些化學試劑后，某種微生物生長過程中產生的特殊代謝產物會與加入的這些化學試劑反應，依靠指示劑的顯色反應，借以鑒別不同種類的微生物。這種培養基稱為鑒別培養基。

例如：檢測飲用水、乳品中是否含腸道致病菌的伊紅-美藍乳糖培養基，即EMB（eosin methylene blue）培養基。其成分是：蛋白胨10g，乳糖10g，K₂HPO₄ 2g，2%伊紅20mL，0.325%美藍20mL，蒸餾水1000mL，pH 7.2。

其中的伊紅和美藍兩種苯胺染料可以抑制革蘭氏陽性菌和一些難培養的革蘭氏陰性菌。試樣中的多種腸道菌會在EMB培養基上產生相互易區分的特征菌落，因而易于辨認。尤其是大腸桿菌，因其強烈分解乳糖而產生大量混合酸，使菌體帶H⁺，很容易染上酸性染料伊紅，伊紅又與美藍結合，其復合物為黑色，所以，大腸桿菌的菌落呈紫黑色并帶金屬光澤，其菌落較小。產氣桿菌產生少量酸，菌落呈棕色；變形桿菌不能發酵乳糖，菌落無色、透明。

（4）選擇培養基　根據某種或某類微生物的特殊營養要求，或對某些物理、化學條件的抗性而設計的培養基，稱為選擇培養基。利用這種培養基可以把某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來。常用抑菌劑或殺菌劑（如染色劑、抗生素等）來抑制不需要的菌的生長，而促進某種需要的菌的生長。

3.根據培養基的物理形狀

（1）液體培養基　各營養成分按一定比例配制而成的水溶液或液體狀態的培養基稱為液體培養基。工業上絕大多數發酵都采用液體培養基。實驗室中微生物的生理、代謝研究和獲取大量菌體也常利用液體培養基。

（2）固體培養基　在液體培養基中加入一定量的凝固劑（如瓊脂、明膠等）配制而成的固體狀態的培養基。固體培養基在科學研究和生產實踐中具有很多用途，例如它可用于菌種分離、鑒定、菌落計數、檢測雜菌、選種、育種、菌種保藏、抗生素等生物活性物質的效價測定及獲取孢子等。在發酵工業常用固體培養基進行固體發酵。

瓊脂是最好的凝固劑。它是從海藻中提取的多糖類物質，主要由瓊脂糖和瓊脂膠兩種多糖組成。除極少數菌外，大多數微生物無法降解瓊脂。瓊脂在45℃固化，約100℃才熔化，滅菌過程中不會被破壞，并且價格低廉。培養基中加0.5%瓊脂可以獲得半固體培養基，加入1.5%～2.0%瓊脂即獲得固體培養基，加8%瓊脂則獲得硬固體培養基。

明膠也是一種凝固劑。它是由動物的皮、骨、韌帶等煮熬而成的一種蛋白質，含有多種氨基酸，可作為許多微生物的氮源。明膠在20℃凝固，28～35℃熔化，所以，只能在20～25℃溫度范圍作凝固劑使用，適用面很窄，但可用于特殊檢驗。

硅膠是硅酸鈉（Na₂SiO₃）和硅酸鉀（K₂SiO₃）與鹽酸和硫酸中和反應時凝結成的膠體。因為它屬于完全的無機物質，在研究分離自養菌時用作培養基的凝固劑。硅膠一旦凝固后，就無法再熔化。

（3）半固體培養基　半固體培養基是指瓊脂加入量為0.2%～0.5%而配制的固體狀態的培養基。半固體培養基有許多特殊的用途，如可以通過穿刺培養觀察細菌的運動能力，進行厭氧菌的培養及菌種保藏等。

4.根據培養基在發酵生產中的應用

（1）繁殖和保藏培養基　主要用于微生物細胞生長、繁殖和保藏，大部分情況下是斜面培養基，包括細菌、酵母菌等的斜面培養基以及霉菌、放線菌產孢子培養基或麩曲培養基等。此類培養基的特點是：①富含有機氮源，少含碳源；②所用無機鹽的濃度要適量；③pH值和濕度要適中。

（2）種子培養基　種子培養基是適合微生物菌體生長的培養基，目的是為下一步發酵提供數量較多、強壯而整齊的種子細胞。種子培養基的一般要求：①氮源、維生素豐富，氮源含量高些，總濃度稀薄；②少量碳源，若糖分過多，菌體代謝活動旺盛，產生有機酸，使pH值下降，菌種容易衰老；③種子培養基成分應與發酵培養基的主要成分相近，以縮短發酵階段的適應期（延滯期）。谷氨酸發酵不同培養基的組成，見表3-7。

（3）發酵培養基　用于生產預定發酵產物的培養基。因此必須根據產物合成的特點來設計培養基。一般的發酵產物以碳為主要元素，所以，發酵培養基中的碳源含量往往高于種子培養基。若產物的含氮量高，應增加氮源。在大規模生產時，原料應該價廉易得，還應有利于下游的分離提取工作。