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- 《乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)》叢書(shū)編委會(huì) 乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室
- 8575字
- 2020-04-30 15:35:57
第一節(jié) 乳蛋白質(zhì)
蛋白質(zhì)是生命體中最豐富和最重要的大分子之一,在生命活動(dòng)中起到重要作用。蛋白質(zhì)由碳、氫、氧、氮及少量硫元素組成。正常的牛乳含有2.2%~4.4%的蛋白質(zhì),是牛乳最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一。乳中蛋白質(zhì)主要包括酪蛋白、乳清蛋白及少量的脂肪球膜蛋白等。
一、乳清蛋白
乳清蛋白大概占蛋白的20%,是pH值4.6等電沉淀酪蛋白后,由在溶液中存在的非酪蛋白組成的。早期的定義包括酪蛋白的N端片斷,但它是從脂肪球膜中分離出來(lái)相當(dāng)于抗原的蛋白。凝乳酶乳清也包含CMP酪蛋白巨肽。
乳清蛋白與酪蛋白相比是更不均勻的成分,很少有共同的性質(zhì),乳清蛋白都是可溶的。不像酪蛋白缺乏二級(jí)結(jié)構(gòu),乳清蛋白有較為規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu),大多數(shù)是球狀蛋白。牛乳中4種主要的乳清蛋白表示為β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白,它們占非酪蛋白95%以上。β-乳清蛋白和α-乳白蛋白在乳腺中合成,而血清白蛋白通過(guò)血清運(yùn)輸?shù)饺橄?。一些種群的牛乳中β-乳球蛋白幾乎沒(méi)有A和B變種,牛乳中的乳清蛋白總的濃度為5~7g/L,不包括1.1g/L的?-胨。
大多數(shù)的乳清蛋白都是球蛋白。它們有很高的疏水性且細(xì)密的折疊結(jié)構(gòu)。大多數(shù)包含一個(gè)α螺旋,電荷分布均一。如果牛乳被加熱乳清蛋白可能變性不溶,也可能發(fā)生相關(guān)的變化,包括蛋白質(zhì)的沉淀。初乳中含有高含量的乳清蛋白,當(dāng)它被加熱時(shí)就會(huì)發(fā)生膠凝,其外觀如雞蛋蛋白。
超出半數(shù)的乳清蛋白是β-乳球蛋白,它有5個(gè)半胱氨酸殘基,能在殘基66~160、119~121或106~119之間形成二硫鍵(Cys66-Cys160和Cys106-Cys119)和一個(gè)自由硫氫基(Cys121)。當(dāng)pH為3~7時(shí),其自締合形成二聚體(圖1-1)。

圖1-1 牛乳β-乳球蛋白的二聚體結(jié)構(gòu)
α-乳白蛋白是乳清蛋白中相對(duì)分子質(zhì)量最小的蛋白質(zhì)分子,相對(duì)分子質(zhì)量為14175。它作為乳糖合成酶系的調(diào)節(jié)物,在乳糖的生物合成中起重要作用。
α-乳白蛋白,遺傳學(xué)上和溶菌酶相近,它的生理功能是合成乳糖的一種輔酶。這種蛋白被緊密折疊,基本上是球狀分子,對(duì)pH值和鹽的依賴性很小,除非離子強(qiáng)度很小,否則不會(huì)產(chǎn)生交聯(lián)。
α-乳白蛋白包含八個(gè)半胱氨酸基團(tuán),每個(gè)基團(tuán)都包括二硫鍵(圖1-2)和四個(gè)色氨酸殘基,α-乳白蛋白中所有8種半胱氨酸殘基通過(guò)位置6~120、28~111、61~77、73~91間二硫鍵連接。它們使α-乳白蛋白在280nm處有最大的吸收。由于芳族氨基酸成分的不同,因此可以通過(guò)紫外線掃描光譜快速測(cè)定乳清蛋白的酶解圖譜。α-乳白蛋白有非常有序的二級(jí)結(jié)構(gòu),同時(shí)流體力學(xué)數(shù)據(jù)表明它有一個(gè)緊密的空間三級(jí)結(jié)構(gòu)。在pH值<4.0時(shí),α-乳白蛋白經(jīng)過(guò)構(gòu)象的變化,同時(shí)伴隨著結(jié)合鈣的釋放。在pH值7.5時(shí),鈣從α-乳白蛋白中釋放出來(lái)。鎂和其他的金屬離子也會(huì)和α-乳白蛋白結(jié)合,在pH值<4.0時(shí),溫度和濃度引起的構(gòu)象變化與α-乳白蛋白的聚合相關(guān)。α-乳白蛋白的熱變性也伴隨著結(jié)合鈣的釋放,α-乳白蛋白在抵抗熱變性方面是穩(wěn)定的,它在鈣存在的條件下發(fā)生聚合。

圖1-2 β-乳球蛋白和α-乳白蛋白中脯氨酸(●)和半胱氨酸(S)的位置、大小(右縱坐標(biāo))和電荷殘基(pH6~7)的正負(fù)
許多研究表明α-乳白蛋白結(jié)合鈣、磷脂和膜。α-乳白蛋白的微量形式含有甘露糖、半乳糖、海藻糖、N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸組成的碳水化合物部分。
和酪蛋白一樣,β-乳球蛋白疏水性很強(qiáng)(平均疏水度=5.1)。它含有非酯化的磷酸鹽和很少量的脯氨酸,僅有兩個(gè)—S—S—鍵,和一個(gè)巰基基團(tuán);但有相當(dāng)多的α螺旋和β折疊結(jié)構(gòu)。β-乳球蛋白的反應(yīng)活性很強(qiáng),它的溶解性主要依賴于pH值和離子強(qiáng)度,但它在牛乳酸化時(shí)不會(huì)發(fā)生沉淀。β-乳球蛋白在純水中不溶解;在牛乳中則以二聚物的形式存在(相對(duì)分子質(zhì)量36566),分子之間緊密連接(主要通過(guò)疏水作用)。二聚物在高溫條件下分離,在pH值較低的條件下(pH值為3.5~5.2時(shí)),β-乳球蛋白形成一個(gè)八聚體;在pH值低于3.4時(shí),解離成單體。遺傳變種在不同程度上(A>B>C)發(fā)生相互交聯(lián)。占優(yōu)勢(shì)的B變種不容易形成八聚體,可能是因?yàn)樗華變種包含更多的電荷基團(tuán)(天門冬氨酸殘基64),增加了靜電排斥。由于構(gòu)象的變化,等電點(diǎn)區(qū)域的交聯(lián)提前發(fā)生,這導(dǎo)致每個(gè)單體黏合一個(gè)質(zhì)子基團(tuán)。構(gòu)象變化,如Tanford轉(zhuǎn)變,發(fā)生在pH值接近7.5左右,導(dǎo)致一個(gè)羧基基團(tuán)暴露,同時(shí)自由的半胱氨酸基團(tuán)活性增強(qiáng),這對(duì)于牛乳的熱交互作用很重要。另外,β-乳球蛋白可能在維生素A的傳輸中起重要作用。
血清白蛋白是由許多個(gè)—S—S—連接的α螺旋結(jié)構(gòu)的大分子,牛乳中的血清白蛋白是從牛的血清轉(zhuǎn)移而來(lái)的。研究表明,乳清白蛋白與血漿蛋白的物理學(xué)和免疫學(xué)鑒定相一致。血清白蛋白含有582個(gè)氨基酸序列。所有的35個(gè)半胱氨基酸殘基(除了34位半胱氨酸外)都形成鏈內(nèi)二硫鍵。分子有3個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域,每個(gè)域由兩個(gè)大雙環(huán)和一個(gè)小雙環(huán)組成,假定成橢圓形狀。N端區(qū)域比C端區(qū)域更緊湊。結(jié)構(gòu)域在疏水性、凈電荷、配體鍵位置不同。血清蛋白等電聚焦結(jié)果顯示重要的蛋白質(zhì)微觀異構(gòu)性的證據(jù)。
免疫球蛋白是為應(yīng)答特定抗原而合成的抗體。它產(chǎn)生于血液,免疫球蛋白的組成呈不均一性,同一個(gè)亞類也是如此。因?yàn)樗鼈儊?lái)自于不同的分泌細(xì)胞,故可能產(chǎn)生不同的肽鏈。
最大(相對(duì)分子質(zhì)量>1000k)、最不均勻的主要乳清蛋白屬于一類群,即熟知的免疫球蛋白,被分為IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。牛乳中的免疫球蛋白,包括G(丙種球蛋白)、A和M(巨球蛋白)(圖1-3)。它們所有或者以單體或者以聚合物形式存在,由兩條輕鏈和兩條重鏈組成基本單元。每個(gè)輕鏈和重鏈分別含有200個(gè)和450~600個(gè)氨基酸殘基。在牛乳中發(fā)現(xiàn)的許多類型免疫球蛋白與其他來(lái)源免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能相似。輕鏈的N端一半(1~115殘基)是易變區(qū)域,因?yàn)樗陌被嵝蛄懈叨纫鬃儭端是穩(wěn)定區(qū)域,因?yàn)榘被嵝蛄胁灰鬃?。重鏈也含有一個(gè)可變區(qū)域(1~115殘基)和一個(gè)穩(wěn)定區(qū)域(310~500殘基)。輕鏈和重鏈的可變區(qū)域與抗原結(jié)合有關(guān),而補(bǔ)體結(jié)合的功能、膜運(yùn)輸、分解代謝和速發(fā)型超敏反應(yīng)介導(dǎo)與重鏈的穩(wěn)定區(qū)域有關(guān)。相對(duì)分子質(zhì)量(MW)約為15000。分子有兩個(gè)抗原結(jié)合部位,它依靠一些交互作用連接:氫鍵、疏水鍵、靜電作用等。免疫球蛋白IgG對(duì)多種抗原具有活性,同時(shí)抑制微生物生長(zhǎng)。IgM由類似于IgG的分子和一個(gè)稱為J的成分聚合而成,它是一個(gè)大分子,相對(duì)分子質(zhì)量大約900000,直徑約為30nm。IgM可以作為抗體抵抗多聚糖基團(tuán)(產(chǎn)生于微生物細(xì)胞壁),能抑制細(xì)菌和病毒,它能使它們絮凝。因?yàn)橐粋€(gè)IgM分子和它們中的兩個(gè)(反應(yīng)位置是在分子的外部)結(jié)合,IgM是凝集素的一部分。這種凝集反應(yīng)呈抗原專一性,但也依賴pH和離子力等因素。最適宜的離子強(qiáng)度約為0.05。一些凝集素在低溫時(shí)會(huì)發(fā)生沉淀。在<37℃,最適宜<15℃時(shí)它們發(fā)生沉淀。它們可能也凝集其他物質(zhì);這是非特異性凝集。

圖1-3 免疫球蛋白G1、A1和M的示意圖雙鍵由破折號(hào)代表。陰影部分表示變化部分
在牛乳中,IgG(1或2)、IgA和IgM濃度變化很大,初乳中濃度很高,而常乳中濃度很低,個(gè)體牛間的差異性很大。牛乳的免疫球蛋白部分也包括部分脂蛋白。IgM在牛乳中很重要,它含有乳抑制素L1和L2,能抑制革蘭氏陰性菌。這些乳抑菌素是乳凝集劑,L1對(duì)乳酸鏈球菌(Lactococcus pyogenes)的變種呈特異性作用,L3對(duì)某些乳酸乳球菌(Lactoccus lactis)有抑制能力。它們的凝集反應(yīng)呈高度專一性。
在熱處理?xiàng)l件下,凝集素會(huì)被鈍化,這一鈍化反應(yīng)與免疫球蛋白變成不溶有關(guān)。均質(zhì)也會(huì)使凝集素鈍化,但原因尚不清楚。
凝集素的主要天然功能是增加小牛的免疫力。在分娩后最初的幾天,小??梢詮某跞橹形彰庖咔虻鞍?,在胃與腸吸收進(jìn)入血液。初乳含有一種成分(一種類似球的蛋白)抑制分解蛋白酶特別是胰蛋白酶(trypsin)。常乳中,基本不含這種成分。此外,凝乳酶不破壞免疫球蛋白,在新生小牛的皺胃中產(chǎn)生的蛋白酶多于胃蛋白酶,但當(dāng)小牛長(zhǎng)大,皺胃中產(chǎn)生更多的胃蛋白酶。
溶菌酶是一種破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的含多糖酶類(從胞壁酸中分離得到),它引起細(xì)菌細(xì)胞膜部分溶解,從而破壞菌體細(xì)胞。它在牛乳中的濃度為0~2mg/L,因?yàn)闈舛忍投鴽](méi)有生理效果。人乳中的溶菌酶含量較高。
乳鐵蛋白具有微生物的抑制作用,抑制的微生物包括嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)等。牛乳中的乳鐵蛋白濃度很低,人乳中的含量相對(duì)較高。
二、酪蛋白
酪蛋白的特性不同于其他牛乳蛋白(圖1-4)。酪蛋白呈疏水性,它含有相當(dāng)高的電荷、大量脯氨酸和少量的胱氨酸。它只有較短的α-螺旋和少量的三級(jí)結(jié)構(gòu)。它在稀釋的溶液中結(jié)構(gòu)伸展,但并不表明酪蛋白分子排列無(wú)序。由于許多脫水基團(tuán)暴露在外,故分子容易形成疏水鍵。酪蛋白具有廣泛的結(jié)合能力,既有自身的結(jié)合也有相互之間的結(jié)合。在溶液中需要相對(duì)比較高的電荷來(lái)維持酪蛋白的穩(wěn)定性。

圖1-4 酪蛋白的肽鏈
縱條分別代表正負(fù)電荷(除靜電核外),這里長(zhǎng)的負(fù)棒代表SerP,短的正棒代表HIS。交叉表示脯氨酸殘基,黑四方表示疏水氨基酸,通過(guò)半胱氨酸間的—S—S—鍵連接。斷開(kāi)的棒表示凝乳酶的作用點(diǎn)。可能位于糖類殘基與蘇氨酸酯化的位置
酪蛋白分子不能或者說(shuō)很難變性,因?yàn)樗鼈兊亩?jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)很少。圖1-5是β-乳球蛋白和β-酪蛋白的變性試驗(yàn)結(jié)果。β-乳球蛋白,是典型的球狀蛋白,在4mol/L的尿素中,發(fā)生明顯的構(gòu)象變化;β-酪蛋白的變化較小。在加熱溫度低于100℃的條件下,酪蛋白不會(huì)變性;而在更高的溫度下,則可能發(fā)生其他許多變化。
酪蛋白帶有大量電荷部分是由磷酸鹽基團(tuán)引起的,部分被酯化的絲氨酸殘基在接近牛乳pH值時(shí),會(huì)大量被離子化。這些基團(tuán)與二價(jià)離子如Ca2+發(fā)生結(jié)合,在pH值較高時(shí)結(jié)合更多。圖1-6中可以看出結(jié)合鈣量和這些基團(tuán)呈正相關(guān),αs1-酪蛋白和β-酪蛋白都在相當(dāng)?shù)外}離子濃度條件下沉淀。

圖1-5 通過(guò)尿素變性指示在280nm比旋光值的變化

圖1-6 在pH值7.4通過(guò)酪蛋白Ca2+連接
磷酸酯鍵成分(mmol/g酪蛋白)被指出點(diǎn)表示脫磷酸的αs1-酪蛋白
牛乳中含有不同的酪蛋白,它們不容易分離。牛乳引起的沉淀反應(yīng)(如酸化、凝乳或者加鈣后離心)都或多或少是酪蛋白的混合物。電泳法可分離酪蛋白,三種成分,即α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。接著α-酪蛋白應(yīng)該被分離成敏感片斷和Ca2+,κ-酪蛋白進(jìn)一步分離產(chǎn)生更純的物質(zhì)。這顯示四種不同的蛋白質(zhì)——αs1-酪蛋白,αs2-酪蛋白,β-酪蛋白和κ-酪蛋白,它們之間的比例是4∶1∶2∶1.6。
牛乳的酪蛋白成分大約是26g/kg,約占牛奶蛋白的80%。基本的酪蛋白分?jǐn)?shù)是αs1-酪蛋白(10g/kg),αs2-酪蛋白(2.6g/kg),β-酪蛋白(0.8g/kg)和κ-酪蛋白(3.3g/kg)。
酪蛋白是磷酸鹽基團(tuán)和絲氨酸酯化得到的結(jié)合蛋白。此外包含磷酸鹽基團(tuán)β-酪蛋白片斷。磷酸鹽基團(tuán)對(duì)于酪蛋白的交聯(lián)和酪蛋白膠束的結(jié)構(gòu)非常重要。由鈣連接酪蛋白和磷酸鹽成分是呈比例的。除了磷酸化,大約1/3的κ-酪蛋白單體是在蘇氨酸133上被糖基化(圖1-4)。
酪蛋白包含大量的脯氨酸殘基,它們?cè)诙嚯逆溕舷鄬?duì)均勻一致地分布。脯氨酸增加肽鏈的彎曲同時(shí)抑制規(guī)則的、穩(wěn)定的α螺旋結(jié)構(gòu)。早期的文獻(xiàn)表明酪蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)很少,但κ-酪蛋白中特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)在50%~75%之間,天然膠束酪蛋白大約有14%的螺旋結(jié)構(gòu)、27%的β結(jié)構(gòu)和41%折疊,僅剩下18%肽鏈結(jié)構(gòu)呈不確定性。酪蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的證據(jù)較好,這使得酪蛋白的熱變性和酪蛋白的穩(wěn)定性相反,三級(jí)結(jié)構(gòu)的缺少需要相當(dāng)多的疏水殘基暴露進(jìn)行支持。
酪蛋白主要是在乳腺中合成的,它們是含有酯結(jié)合磷酸鹽的蛋白質(zhì),脯氨酸的含量相對(duì)較高。
(一)αs1-酪蛋白
含有199個(gè)氨基酸殘基的αs1-酪蛋白沒(méi)有半胱氨酸殘基,有結(jié)合8個(gè)磷酸鹽的絲氨酸。具有較快電泳遷移率的αs1-酪蛋白,以前被αs0-酪蛋白表示,它已經(jīng)被定性,其與攜帶9個(gè)磷酸基的絲氨酸的前體略微不同,因此它在堿性pH條件下含有一個(gè)額外負(fù)電荷,3個(gè)疏水區(qū)域位于序列殘基的1~44、90~113和132~199。41~80殘基序列具有很強(qiáng)的極性,這是由于其存在7個(gè)絲氨酰磷酸鹽、8個(gè)谷氨酸和3個(gè)天冬氨酸。
αs1-酪蛋白帶有最多的電荷和含有最多的磷酸成分。從圖1-7可看出,在pH6.6和離子強(qiáng)度0.05mol/m3時(shí),αs1-酪蛋白發(fā)生很強(qiáng)的交聯(lián)。顯而易見(jiàn),要得到?jīng)]有交聯(lián)的分子,要求酪蛋白濃度很低。另一方面,減少離子濃度增加靜電斥力的有效范圍,可以降低交聯(lián)。疏水作用也包括在交聯(lián)作用中。在pH值較高時(shí),即電荷較多時(shí),即使酪蛋白濃度和離子濃度很高,交聯(lián)仍會(huì)降低,并最終消失。

圖1-7 αs1-酪蛋白和β-酪蛋白交聯(lián)與濃度之間的函數(shù)
αs1-酪蛋白(pH6.6)和β-酪蛋白(pH7.0),溫度21℃,斷開(kāi)線24℃,在曲線中指出的是離子強(qiáng)度(mol·m3)
變種αs0-酪蛋白,結(jié)構(gòu)上比αs1-酪蛋白多一個(gè)磷酸鹽基團(tuán),牛乳中的數(shù)量很少。
(二)αs2-酪蛋白
酪蛋白存在一些變種,它們的酯化磷酸鹽基團(tuán)的數(shù)量不同,每分子為10~14個(gè),這種蛋白稱為αs2-酪蛋白。αs2-酪蛋白包含207個(gè)氨基酸,含10個(gè)脯氨酸,與其他酪蛋白相比包含更多的磷酸化絲氨酸和賴氨酸,并在36和40位上都是半胱氨酸。由于磷酸化程度的不同,αs2-酪蛋白的多種形式可以通過(guò)PAGE鑒定,磷酸化程度變化范圍為10~14。這些形式被鑒定為αs2-酪蛋白、αs3-酪蛋白、αs4-酪蛋白、αs5-酪蛋白、αs6-酪蛋白(αs5-酪蛋白是αs3-酪蛋白和αs4-酪蛋白的二聚體)。13個(gè)磷酸基(12個(gè)結(jié)合在絲氨酸上,1個(gè)結(jié)合在蘇氨酸上)位于分子3個(gè)區(qū)域:7~31殘基、55~66殘基和129~143殘基。在酪蛋白中,αs2-酪蛋白疏水作用最差,其疏水區(qū)域位于90~120殘基和160~207殘基。αs2-酪蛋白包含兩個(gè)半胱氨酸殘基(形成一個(gè)—S—S—橋),沒(méi)有碳水化合物基團(tuán),它們對(duì)Ca2+敏感。
αs2-酪蛋白組分的疏水性最?。╬H4.6)、磷酸化程度最高且最易變。在酪蛋白序列中有三個(gè)磷酸肽區(qū)域(5~18位、49~68位和126~145位)和一個(gè)帶有很少量電荷的巨大疏水區(qū)域(90~120位)。第二大疏水區(qū)域(160~207位)有許多帶電荷殘基。蛋白質(zhì)在許多位點(diǎn)上可被纖維酶水解。
(三)β-酪蛋白
β-酪蛋白是疏水性最強(qiáng)的酪蛋白,沒(méi)有半胱氨酸,有高比例的脯氨酸(35個(gè)殘基),這對(duì)其結(jié)構(gòu)具有極大的影響。在乳正常pH值條件下,N端21個(gè)殘基片斷有較高的負(fù)電荷,而分子沒(méi)有凈電荷,極度疏水。β-酪蛋白分子的兩性性質(zhì)是其在溶液中形成膠束聚合物的原因。β-酪蛋白是具有相同氨基酸序列的6種蛋白質(zhì)組成的,但在絲氨酸殘基上結(jié)合0~5個(gè)磷酸基。很早就知道的γ-酪蛋白是β-酪蛋白經(jīng)纖溶酶作用的水解產(chǎn)物。與β-酪蛋白殘基29~209、106~209和108~209相應(yīng)γ-酪蛋白存在于pH4.6時(shí)全酪蛋白的等電沉淀物中。在乳清中發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白的其他片段(1~28、1~105、1~107殘基),它們構(gòu)成的部分片段以前被認(rèn)為是“朊胨”。
β-酪蛋白是疏水性最強(qiáng)的酪蛋白,其高度疏水區(qū)域最大(55~90位和130~209位),并且24個(gè)氨基酸N端區(qū)域酸性極強(qiáng)。它有2個(gè)易被纖溶酶切割區(qū)域(28~29位和105~106位/107~108位)和一個(gè)對(duì)凝乳酶極敏感的區(qū)域(189~190位/192~193位)。像αs2-酪蛋白中對(duì)酶敏感位點(diǎn)一樣,這些區(qū)域是螺旋(20~30位和90~108位)和折疊(185~195位)。C端肽(193~209位)的丟失明顯改變了解離平衡。例如,在高溫條件下,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被締合時(shí)凝乳酶切割速度極慢,可能因?yàn)槊附咏懈钗稽c(diǎn)受到限制,也可能因?yàn)槭杷悦盖形稽c(diǎn)是結(jié)合位點(diǎn)的一部分。這導(dǎo)致增加反應(yīng)溫度但減少了切割速率。β-酪蛋白含有大量的脯氨酸殘基。從圖1-4可以看出,β-酪蛋白的電荷分布不均衡。分子從N端開(kāi)始的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)如下:
第一段 第二段
殘基順序數(shù) 1~43 44~209
脯氨酸頻數(shù) 0.02 0.20
電荷頻數(shù) 0.65 0.12
靜電荷 -15.5 +4.5
平均疏水性(每殘基kJ) 3.3 6.0
每一部分在性質(zhì)上都有較大差別,因而β-酪蛋白有點(diǎn)像親水的脂肪酸鹽分子,有帶電荷的“頭”、一個(gè)長(zhǎng)鏈以及沒(méi)有極性的尾。β-酪蛋白膠束由20~30個(gè)分子組成,交聯(lián)和溫度、離子強(qiáng)度有很大的相關(guān)性。低于5℃,β-酪蛋白不發(fā)生交聯(lián),分子保持分散。在牛乳中,部分的β-酪蛋白在低溫下溶解,因而會(huì)增加牛乳的黏度。這些變化是可逆的,但變化速率緩慢。
(四)γ-酪蛋白
γ-酪蛋白是β-酪蛋白的降解產(chǎn)物,它是β-酪蛋白29~209位肽鏈片斷,有更多的疏水基,易溶于乙醇中(在50%的乙醇溶液中,溶解度為900mg/L),αs-酪蛋白的溶解度只有9mg/L。其分解主要是血漿酶引起的(EC3.4.21.7)。γ-酪蛋白的數(shù)量變化很大,這主要和牛乳的保存溫度和時(shí)間有關(guān)。
(五)κ-酪蛋白
κ-酪蛋白是酪蛋白家族中唯一被糖基化的蛋白質(zhì)。在PAGE中顯示的前七條帶中,糖基化程度差異與N-乙酰神經(jīng)氨酸殘基負(fù)電荷的數(shù)量有關(guān)。κ-酪蛋白是凝乳酶作用的產(chǎn)物,是研究最廣泛的乳蛋白。它穩(wěn)定酪蛋白膠束不被鈣離子沉淀,但當(dāng)Phe105~Met106肽鍵被酶分解成兩個(gè)肽時(shí)[副-κ-酪蛋白(1~105位殘基片段)],疏水性部分,隨酪蛋白膠束一同沉淀;酪蛋白糖巨肽(106~169位殘基片段),由于它的強(qiáng)極性和高負(fù)電荷,所以殘留在溶液中,這種穩(wěn)定作用喪失。通過(guò)O-糖苷鍵,糖基部分可以和酪蛋白糖巨肽的131、133、135或142位上蘇氨酸結(jié)合。κ-酪蛋白2個(gè)半胱氨酸殘基位于11和88位,絲氨酸在149位,有時(shí)在127位被磷酸化。κ-酪蛋白兩性性質(zhì)促進(jìn)其在溶液中形成膠束。不同于其他酪蛋白,κ-酪蛋白不能強(qiáng)烈的結(jié)合鈣離子,對(duì)鈣離子誘導(dǎo)沉淀不敏感。
κ-酪蛋白和其他酪蛋白有較大的差異性,它們中的兩個(gè)半胱氨酸殘基形成分子內(nèi)二硫鍵,因此κ-酪蛋白在牛乳中產(chǎn)生5~11個(gè)單體的低聚物,大約2/3的分子含有一個(gè)碳水化合物基團(tuán),它是蘇氨酸的酯化產(chǎn)物(131、133、135或者142位),還含有半乳糖胺、半乳糖或者一個(gè)或兩個(gè)N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA或者O-唾液酸)殘基,見(jiàn)圖1-8。這些基團(tuán)每個(gè)含有一個(gè)或者兩個(gè)負(fù)電荷和相當(dāng)多的疏水基。此外還形成一些其他小的結(jié)構(gòu),故κ-酪蛋白分子有較大差異性。又因?yàn)樗鼈冎械囊恍┯袃蓚€(gè)酯化磷酸基團(tuán),因此微觀組成上的不均一性經(jīng)常發(fā)生;即使對(duì)同一乳牛,也會(huì)發(fā)生這種情況。
在105~106位殘基之間的肽鍵很易被凝乳酶水解(Met105-Phe106),值得注意的是這里有一個(gè)正電荷區(qū)域靠近這一肽鍵。

圖1-8 糖基團(tuán)與κ-酪蛋白間的連接頂部的N'-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA)殘基經(jīng)常缺失
κ-酪蛋白總是強(qiáng)烈交聯(lián)產(chǎn)生膠束,膠束含有大約30個(gè)κ-酪蛋白分子,包括碳水化合物基團(tuán)。這種交聯(lián)有些類似于β-酪蛋白,在分子之間有大量不同的交聯(lián)。這些不同主要涉及碳水化合物成分。
κ-酪蛋白占總酪蛋白的10%~12%,在穩(wěn)定乳中酪蛋白膠束起決定性作用。在酶切之后,降低了交替酪蛋白的穩(wěn)定性。對(duì)新生兒營(yíng)養(yǎng)和許多干酪的生產(chǎn)來(lái)說(shuō),引起這種轉(zhuǎn)化的酶切是重要的。這可以通過(guò)有兩個(gè)明顯不同結(jié)構(gòu)域的分子來(lái)完成,這些域在中性pH條件下通過(guò)酸性蛋白酶水解一個(gè)肽鍵而分開(kāi)。N端域(1~95位殘基)帶有凈正電荷,疏水性強(qiáng),與其他酪蛋白相互作用強(qiáng)烈。C端域(113~169位殘基)攜帶一個(gè)凈負(fù)電荷,還有一個(gè)占優(yōu)勢(shì)的極性殘基。這些域通過(guò)帶有凈正電荷的肽鏈(96~112位殘基)連接,此肽一般預(yù)測(cè)為β股,并通常完好地保存在許多物種,含有一個(gè)能快速被凝乳酶識(shí)別序列,經(jīng)快速和特異切割得到一個(gè)巨大疏水性肽[副-κ-酪蛋白,κ-酪蛋白(f1~105)]和一個(gè)較小親水肽[酪蛋白糖聚肽(CMP),也叫糖巨肽(GMP),κ-酪蛋白(f106~169)]。
作為一個(gè)還原的、分離的蛋白質(zhì),κ-酪蛋白自締合與β-酪蛋白類似。然而,在乳中κ-酪蛋白以一系列分子內(nèi)二硫鍵聚合物的形式存在。當(dāng)酪蛋白膠束在上皮細(xì)胞中裝配之后,可能產(chǎn)生良好的聚合反應(yīng)。此蛋白質(zhì)的絕大多數(shù)性質(zhì)不受聚合反應(yīng)狀態(tài)影響。大約一半κ-酪蛋白分子在一個(gè)或更多的下列蘇氨酸位點(diǎn)上與短寡糖鏈進(jìn)行翻譯后糖基化:131、133、135、136(僅變異體B)或142位;多數(shù)κ-酪蛋白分子在Ser(149)位上磷酸化。
(六)酪蛋白的交聯(lián)性質(zhì)和鈣沉淀敏感性的關(guān)系
除了溶液中單個(gè)酪蛋白之間相互作用之外,許多研究涉及了多個(gè)混合物之間相互作用。這些研究顯示在缺乏多價(jià)陽(yáng)離子的條件下,溫度為25~37℃時(shí),αs1-酪蛋白和κ-酪蛋白締合最強(qiáng),其次是αs1-酪蛋白和β-酪蛋白,然后是αs1-酪蛋白的自締合作用。然而,這些關(guān)系很大程度取決于環(huán)境條件,尤其是溫度。
αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白都含有兩個(gè)半胱氨酸殘基,其他酪蛋白不含半胱氨酸。二硫化物和κ-酪蛋白的多聚體相連,多聚體的單體數(shù)范圍從三個(gè)到非常大(見(jiàn)圖1-9)。αs2-酪蛋白存在共價(jià)的二聚物(二硫化物)。酪蛋白的電荷分布區(qū)別很大,可通過(guò)它們對(duì)鈣沉淀的敏感性加以區(qū)分。

圖1-9 酪蛋白中Pro(●)和Cys(S)帶電殘基位置、大?。ㄓ铱v坐標(biāo))和電荷正負(fù)
a—糖殘基位置;b—凝乳酶的作用點(diǎn)
αs1-酪蛋白由兩個(gè)疏水區(qū)域(殘基1~44和99~199)。這些區(qū)域包含脯氨酸殘基,由一個(gè)兩極區(qū)域區(qū)分(殘基45~89)。αs1-酪蛋白在pH值為中性時(shí)的穩(wěn)定性依賴于離子強(qiáng)度和溫度,這種穩(wěn)定性主要?dú)w因于疏水反應(yīng)和氫鍵,αs1-酪蛋白在Ca2+(7mmol/L)很低的水平會(huì)發(fā)生沉淀。αs2-酪蛋白在N端附近帶有負(fù)電荷,在C端附近帶有正電荷,它和αs1-酪蛋白在pH值中性附近發(fā)生交聯(lián),對(duì)鈣沉淀的敏感性方面和αs1相似。
β-酪蛋白有一個(gè)高電荷的N端區(qū)域和一個(gè)疏水性的C端區(qū)域,它具有類似清潔劑的性質(zhì)。它對(duì)鈣沉淀的敏感性比αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白低,但它的交聯(lián)與溫度相關(guān)性大,這表明疏水交聯(lián)是非常重要的,尤其是在分子的疏水部位被解離的情況下。β-酪蛋白是所有酪蛋白中水溶性最強(qiáng)的,在較低的溫度下,其特征更加明顯。牛乳中β-酪蛋白有較高的等電點(diǎn)(大約5.2),比αs1-酪蛋白(大約4.8)高,這對(duì)于形成酸性膠體很重要。
κ-酪蛋白的二硫化物聚合物通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合,形成相對(duì)分子質(zhì)量為600000~650000的聚合物。這些聚合物在pH值中性條件下很穩(wěn)定,離子強(qiáng)度或溫度變化不發(fā)生解離。κ-酪蛋白對(duì)鈣的沉淀有相當(dāng)強(qiáng)的抵抗作用,同時(shí)能在相當(dāng)于10倍的αs-酪蛋白和β-酪蛋白抵抗鈣情況下才發(fā)生沉淀。在凝乳酶將κ-酪蛋白在Phe105-Met106肽鍵解離后,穩(wěn)定性喪失,生成副para-κ-酪蛋白(殘基1~105)的疏水部分和親水部分的糖聚肽(CMP)(殘基106~169)。因?yàn)?i>κ-酪蛋白的主要變種沒(méi)有被糖基化,CMP表觀相對(duì)分子質(zhì)量約為33000(凝膠色譜法);但十二烷基硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠電泳分析其相對(duì)分子質(zhì)量小于18000。
酪蛋白所有的自身交聯(lián)和之間的聚合產(chǎn)生和鈣離子有關(guān)。各種酶蛋白對(duì)鈣離子的敏感性依次為αs2-酪蛋白、αs1-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白。酪蛋白和乳清蛋白形成聚合是在熱處理情況下發(fā)生的。
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