1.4.2　蛋白質(zhì)-配體結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

幾種類型的算法已發(fā)展用來預(yù)測(cè)配體結(jié)合位點(diǎn)。一些算法主要分析蛋白質(zhì)表面的口袋。許多研究表明，結(jié)合位點(diǎn)通常位于最大口袋。一種算法分析放置在蛋白質(zhì)周圍的網(wǎng)格上探針的結(jié)合能，探針聚類和能量輪廓分析可以用來預(yù)測(cè)配體結(jié)合位點(diǎn)。另外，更復(fù)雜的模擬方法也可用于預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)，例如用分子動(dòng)力學(xué)模擬來識(shí)別配體結(jié)合位點(diǎn)，重要?dú)埢挥陟o電不利的位置。

一系列功能比較工具也可用來識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)，包括3D模板[29，30]、圖論[31，32]、模糊模式匹配[33]和進(jìn)化跟蹤方法[34]。這些工具可用于為新解析的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行功能注釋，通常不用在基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)(structure-based drug design，SBDD)結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)研究，它們更經(jīng)常被用來為來自結(jié)構(gòu)基因組學(xué)項(xiàng)目的新解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)注釋功能。其他方法包括結(jié)合位點(diǎn)上氨基酸在進(jìn)化過程中發(fā)生同步變異(相關(guān)突變)，已應(yīng)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)[35]。也有人指出，脯氨酸殘基往往存在于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)中[36]。應(yīng)當(dāng)指出的是，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)通常需要不同的計(jì)算方法，后續(xù)將討論這一內(nèi)容。

預(yù)測(cè)配體結(jié)合位點(diǎn)存在著許多問題。一個(gè)主要的問題是誘導(dǎo)契合。配體結(jié)合時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)可以顯著改變形狀。另一個(gè)問題是配體結(jié)合位點(diǎn)會(huì)位于亞基界面之間。有些算法只測(cè)試過單亞基，已被證明在復(fù)合體數(shù)據(jù)集測(cè)試時(shí)較差。第三個(gè)問題是存在著配體的絕對(duì)多樣性，以及相應(yīng)多樣的結(jié)合位點(diǎn)，很難設(shè)計(jì)一個(gè)算法，對(duì)所有構(gòu)象上和物理化學(xué)上不同的配體結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)。目前還存在著結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具驗(yàn)證的問題。通常，一個(gè)成功的預(yù)測(cè)是指涵蓋了一定數(shù)量的配體原子。然而，如果預(yù)測(cè)的位點(diǎn)非常大(例如，覆蓋了整個(gè)蛋白質(zhì))，預(yù)測(cè)仍然可能是成功的，盡管它不是很精確。在一般情況下，基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)需要對(duì)配體結(jié)合位點(diǎn)做準(zhǔn)確定義，以限制蛋白質(zhì)相關(guān)區(qū)域的搜索空間，減少假陽性結(jié)果。我們探索了作為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)的第一步、用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)-配體結(jié)合位點(diǎn)的一些不同方法，以幾何和能量為基礎(chǔ)的口袋檢測(cè)方法作為主要的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)方法，因此，以下集中介紹這些方法。另外，越來越多的功能點(diǎn)預(yù)測(cè)和“盲對(duì)接”的方法在基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)中發(fā)揮作用，因此，以下也會(huì)涉及一些相關(guān)的進(jìn)展。

1.4.2.1　基于幾何的方法

蛋白質(zhì)口袋檢測(cè)是一種廣泛使用的技術(shù)，可用來識(shí)別潛在的配體結(jié)合位點(diǎn)。它采用幾何因素來定義口袋，并且有研究表明，結(jié)合位點(diǎn)通常是在最大的口袋里找到的。例如，SurfNet[37]用來分析67個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并在83%的情況下發(fā)現(xiàn)配體結(jié)合位點(diǎn)在最大的口袋里[23]。APROPOS[38]通過發(fā)現(xiàn)可以容納分子基團(tuán)的洞穴的特征模式，取得較高的預(yù)測(cè)成功率。其他的口袋檢測(cè)算法有Cavity Search[39]、POCKET[40]、VOIDOO[41]、LIGSITE[42]、CAST[43，44]、PASS[45]、LigandFit[46]以及Delaney[47]、Del Carpio等[48]、Masuya和Doi[49]開發(fā)的算法。

口袋檢測(cè)算法經(jīng)常采用圍繞蛋白質(zhì)的三維網(wǎng)格或一個(gè)分子表面定義。分子表面可以只使用網(wǎng)格來定義，即通過查找碰不到蛋白質(zhì)(的)原子的格點(diǎn)組成的界面。這種技術(shù)已經(jīng)被LIGSITE、POCKET和Delaney的方法所使用。分子表面算法也能使用，這類算法的優(yōu)勢(shì)是不依賴網(wǎng)格的分辨率。分子表面算法一般依賴于在表面滾動(dòng)的“溶劑”探針的半徑(通常為水，具有1.4?的半徑)。Lee和Richards的溶劑可及表面[50]是由探針中心定義的表面，而分子表面或Connolly表面[51]定義為蛋白質(zhì)溶劑的界面，即完全排除了溶劑體積表面，因此定義了溶劑探針與蛋白質(zhì)原子范德華表面之間的接觸點(diǎn)。下面，詳細(xì)地說明幾個(gè)口袋檢測(cè)算法。

(1)POCKET算法　一個(gè)半徑為3?的探針球沿蛋白質(zhì)三維網(wǎng)格中笛卡爾坐標(biāo)X、Y、Z方向上遍歷每條線。如果蛋白質(zhì)的一個(gè)原子的中心位于探針球范圍內(nèi)，可判斷為蛋白質(zhì)和探針球之間相互作用。如果一段相互作用后跟著一段沒有相互作用的空間，緊跟著又出現(xiàn)相互作用，就發(fā)現(xiàn)了一個(gè)口袋。在圖1.12中口袋為“小點(diǎn)”區(qū)域。該算法的主要缺點(diǎn)是，口袋里的確切性質(zhì)依賴于蛋白質(zhì)的相對(duì)旋轉(zhuǎn)角度的坐標(biāo)參考框架。

(2)LIGSITE算法和Pocket-Finder算法　LIGSITE非常相似于POCKET。然而，LIGSITE還可以沿著立方體對(duì)角線方向掃描，即七個(gè)掃描方向，而不是三個(gè)方向。這使得蛋白質(zhì)口袋較少依賴于蛋白質(zhì)的三維網(wǎng)格取向(比較圖1.12和圖1.13)。LIGSITE具有被稱為MINPSP(minimum protein-site-protein，最小的蛋白質(zhì)-位點(diǎn)-蛋白質(zhì))的閾值變量。一單網(wǎng)格點(diǎn)有七條探針線穿過它(X、Y、Z和四個(gè)立方對(duì)角線)。該格點(diǎn)可以多至七次被定義為一個(gè)口袋(PSP事件)。MINPSP閾值可以定義一個(gè)格點(diǎn)必須發(fā)生多少次PSP事件才被定義為一個(gè)口袋的部分。通過設(shè)置高閾值，淺口袋被排除在外。LIGSITE進(jìn)行了十個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證，并表現(xiàn)出良好效果，其中，七個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)在最大口袋中。這一類算法的準(zhǔn)確性、便捷性，非常適合并且已在若干后續(xù)研究，包括在CavBase[52]和SuperStar[53]中使用。

(3)Delaney的算法　蛋白質(zhì)置于一個(gè)三維網(wǎng)格中，凡是與蛋白質(zhì)相交的格點(diǎn)設(shè)置為‘true’，否則設(shè)置為‘false’[圖1.14(a)]?？诖鼨z測(cè)操作如下：首先，將與蛋白質(zhì)表面(和腔邊界)相交的格點(diǎn)設(shè)置為‘true’，而其相鄰格點(diǎn)設(shè)置為‘false’；然后，進(jìn)行表面膨脹操作，即將單層的粒子添加到蛋白質(zhì)表面(表面膨脹)，再重新設(shè)置‘true’和‘false’[圖1.14(b)]；接著進(jìn)行表面收縮操作，即使表面上的單層粒子被刪除[圖1.14(c)]。經(jīng)過反復(fù)擴(kuò)展和收縮(通常為5～10次)，蛋白質(zhì)腔充滿顆粒[圖1.14(d)]。這是因?yàn)橥ㄟ^口袋擴(kuò)展添加的粒子并不會(huì)被定義為蛋白質(zhì)表面部分。

(4)PASS算法　PASS使用了類似于Delaney的算法，所不同的是該算法著眼于三個(gè)蛋白質(zhì)原子的所有可能組合。如果三個(gè)原子足夠接近在一起，該算法只計(jì)算出探針球接觸到的所有三個(gè)蛋白原子的兩個(gè)可能的表面位置(圖1.13)。如果它們與蛋白質(zhì)原子之間有碰撞，探針將被拒絕。其他過程類似于Delaney的算法。

(5)Del Carpio等的算法　該算法采用了表面“生長(zhǎng)”的過程，以確定腔和口袋。分子表面首先利用Lee和Richards方法識(shí)別。首先標(biāo)記距離該蛋白質(zhì)重心最近的表面原子[圖1.16(a)]，然后標(biāo)記周圍的表面原子(第一個(gè)原子的視準(zhǔn)線以內(nèi))，從而識(shí)別出第一個(gè)凹口袋。然后，搜索一個(gè)離重心最近的未標(biāo)記(unflagged)原子，重復(fù)此過程。該算法將持續(xù)到表面上沒有更多的凹區(qū)域可識(shí)別[圖1.16(b)]。

(6)APROPOS算法　APROPOS算法基于一個(gè)蛋白質(zhì)的α-形狀(α-shape)表示展開。α-形狀表示即是使用α-形狀生成算法創(chuàng)建的蛋白質(zhì)Delaunay表示。α-形狀的性質(zhì)依賴于參數(shù)‘α’，這可以被認(rèn)為是一個(gè)從蛋白質(zhì)表面滾過的探針球的半徑。探針可以清除兩側(cè)和三角形的邊緣，但不是頂點(diǎn)(原子中心)。當(dāng)探針球半徑趨于無窮大時(shí)形成凸殼(圖1.17)。實(shí)際操作時(shí)，使用約20?的實(shí)驗(yàn)值，否則假陽性口袋會(huì)被發(fā)現(xiàn)。通過使用介于2.8?(氧原子半徑)和4.5?(甲基半徑)的α，發(fā)現(xiàn)可以結(jié)合配體基團(tuán)的口袋?？诖ㄟ^比較α-形狀和凸殼的結(jié)構(gòu)來確定，若兩者結(jié)構(gòu)差異很大，則可認(rèn)為存在口袋。

人們已經(jīng)注意到，配體基團(tuán)往往適應(yīng)蛋白質(zhì)分子中的小“洞穴”。APROPOS還通過搜索這些特征“洞穴”來預(yù)測(cè)哪個(gè)口袋里是配體結(jié)合位點(diǎn)，該算法被證明對(duì)一個(gè)由亞基組成的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集有95%的成功率，但當(dāng)用蛋白復(fù)合物進(jìn)行測(cè)試時(shí)，準(zhǔn)確率要低得多。

(7)CAST算法　CAST采用類似于APROPOS的方法來檢測(cè)蛋白口袋，并用離散流理論來確定哪類口袋滿足要求(圖1.18)。該算法測(cè)試了含67個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)集。當(dāng)使用CAST時(shí)，74%的配體結(jié)合位點(diǎn)被確定在最大的口袋，而使用SurfNet時(shí)是83%。然而，由于口袋大小和性質(zhì)所產(chǎn)生的差別，將這些結(jié)論之間進(jìn)行直接比較非常困難。CAST已推出CASTp(表1.3)可在網(wǎng)上使用。

(8)SurfNet算法　SurfNet通過選中蛋白質(zhì)上的原子對(duì)，在它們之間形成了一個(gè)測(cè)試球。如果測(cè)試球與蛋白原子有任何重疊，則減小測(cè)試球的半徑，直到不再有重疊[圖1.19(a)為一個(gè)蛋白質(zhì)口袋，白色圓形代表蛋白質(zhì)原子。對(duì)于每對(duì)原子(條紋標(biāo)識(shí))，做出一個(gè)測(cè)試球(淺灰色圓形，并有點(diǎn)狀輪廓)。如果測(cè)試球與蛋白質(zhì)原子重疊，其半徑就縮小直到它們不再重疊(深灰色圓形)。如果半徑低于一個(gè)設(shè)定值(比如1.0?)，測(cè)試球就不放在這個(gè)位置。這個(gè)過程將繼續(xù)，并測(cè)試所有相關(guān)原子對(duì)，直到口袋被球填滿。]因此，測(cè)試球聚集在口袋和洞穴中[圖1.19(b)]，半徑在1～4?之間的測(cè)試球保留。SurfNet已可供下載(見表1.4)。

1.4.2.2　基于能量的方法

目前，已經(jīng)形成了一些估算在一個(gè)給定點(diǎn)上探針分子(如亞甲基，羥基或胺基)和蛋白之間的相互作用能的方法，其可用來識(shí)別與探針親和的位點(diǎn)。以下對(duì)這些方法做一簡(jiǎn)要的介紹。

(1)Goodford的方法　Goodford等發(fā)展了一種GRID方法，它識(shí)別與特定探針類型親和的位點(diǎn)，這對(duì)于從能量輪廓角度分析蛋白質(zhì)表面以找到有利的位點(diǎn)是特別有用的，該方法目前已廣泛應(yīng)用于以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)。因?yàn)樗茏R(shí)別蛋白質(zhì)哪些部分可能與一個(gè)類似藥物分子的官能團(tuán)相互作用，例如，已經(jīng)使用GRID方法識(shí)別了類似藥物分子的氫鍵勢(shì)能[54，55]。同時(shí)Miranker等的多拷貝同步搜索(MCSS)方法[56]也被用于檢測(cè)不同官能基團(tuán)的有利結(jié)合位點(diǎn)。然而，無論是什么方法都不能直接用于定位一個(gè)蛋白質(zhì)上的配體結(jié)合位點(diǎn)。

(2)Ruppert等的方法　Ruppert等發(fā)展了在給定點(diǎn)上估算探針和蛋白質(zhì)之間相互作用能的方法。他們利用 Jain開發(fā)的打分函數(shù)[57]優(yōu)化三個(gè)不同探針類型的相互作用能(疏水性的氫原子；氫鍵供體：NH，氫鍵受體：CO等)。他們保留了最有利的相互作用能探針，然后確定“粘點(diǎn)”，這是探針具有最高相互作用能量密度的區(qū)域。下一步，口袋生長(zhǎng)，通過在“粘點(diǎn)”周圍的蛋白空白區(qū)定義非蛋白球。最后，增長(zhǎng)過程發(fā)生，通過把口袋定義的附近的可及探針加進(jìn)去，擴(kuò)大粘點(diǎn)為更大的口袋。因此，能量和幾何標(biāo)準(zhǔn)都用來定義一個(gè)配體結(jié)合位點(diǎn)。他們的算法被證明在九個(gè)配體結(jié)合和兩個(gè)非配體結(jié)合的蛋白質(zhì)中取得良好的效果。

(3)Q-SiteFinder方法　Q-SiteFinder通過聚類蛋白質(zhì)表面上范德華力(甲基)探針有利的區(qū)域來定位配體結(jié)合位點(diǎn)(圖1.18)。它使用的GRID力場(chǎng)參數(shù)[58]估算在一個(gè)涵蓋整個(gè)蛋白質(zhì)的三維網(wǎng)格所有點(diǎn)上探針的相互作用能。具有有利能量的探針被保留，并根據(jù)它們的空間距離聚集成類。各類根據(jù)自己的總相互作用能進(jìn)行排序。

該算法已被證明在前三名有正確預(yù)測(cè)的情況下，對(duì)于Nissink等描述的GOLD對(duì)接測(cè)試集(134個(gè)蛋白質(zhì)-配體復(fù)合體)取得了90%的預(yù)測(cè)成功率[59]。而對(duì)于非結(jié)合態(tài)蛋白測(cè)試集，成功率(86%)呈小幅下降，這可能是因?yàn)檎T導(dǎo)契合的影響。

Q-SiteFinder使用一個(gè)精確度閾值來判斷預(yù)測(cè)成功與否。精確度定義為與配體距離小于1.6?的探針在一個(gè)集群內(nèi)的百分比。精確度閾值25%用來定義一個(gè)成功的預(yù)測(cè)，即Q-SiteFinder預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)探針集群中，如果與配體距離小于1.6?的探針?biāo)嫉谋壤^25%，那么就判定這個(gè)探針集群預(yù)測(cè)成功。對(duì)于蛋白質(zhì)分子來說，這個(gè)探針集群所占據(jù)的區(qū)域是一個(gè)真實(shí)的結(jié)合位點(diǎn)。Q-SiteFinder把它發(fā)現(xiàn)的所有位點(diǎn)按照精確度標(biāo)準(zhǔn)由大到小進(jìn)行排序，在排名第一的位點(diǎn)作為結(jié)合位點(diǎn)的原則下取得了平均68%的準(zhǔn)確率。Q-SiteFinder還與口袋檢測(cè)類算法Pocket-Finder進(jìn)行了比較、優(yōu)化，并在與Q-SiteFinder相同的數(shù)據(jù)集下進(jìn)行了測(cè)試。只有在當(dāng)精確度閾值下降到0時(shí)，Pocket-Finder才能夠取得與Q-SiteFinder相近的成功率。Pocket-Finder以最大口袋為預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)取得了平均29%的準(zhǔn)確率。另外，Q-SiteFinder和Pocket-Finder均提供在線預(yù)測(cè)服務(wù)(表1.3)。

(4)Pocketome方法　該算法類似于Q-SiteFinder，它通過創(chuàng)建一個(gè)三維網(wǎng)格，計(jì)算出每個(gè)點(diǎn)的范德華勢(shì)能。然后，勢(shì)能圖平滑處理，識(shí)別有利結(jié)合能和可能結(jié)合配體的封套(ligand binding envelopes)，體積超過100?3的封套區(qū)域被保留。該算法使用預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)的封套區(qū)域與真實(shí)配體結(jié)合位點(diǎn)的覆蓋率閾值[60]來判別預(yù)測(cè)成功與否，當(dāng)覆蓋率閾值設(shè)定為80%時(shí)，5616個(gè)蛋白-配體結(jié)合位點(diǎn)中有85.7%能被正確識(shí)別。這些被識(shí)別的位點(diǎn)絕大多數(shù)是最大口袋。

1.4.2.3　統(tǒng)計(jì)和機(jī)器學(xué)習(xí)方法

統(tǒng)計(jì)蛋白配體的接觸和取向分析也可以用來預(yù)測(cè)配體結(jié)合位點(diǎn)，例如PATCH[61]的開發(fā)是為了檢測(cè)碳水化合物結(jié)合位點(diǎn)，在測(cè)試包含40個(gè)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)集時(shí)取得了65%的成功率。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)基于活性位點(diǎn)的相似性[62，63]辨識(shí)，也被用來進(jìn)行酶的分類。同樣，基于表面性質(zhì)的方法也被用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用，包括支持向量機(jī)的使用[64]。Stahl等使用Connolly算法來計(jì)算溶劑可及表面積，并定義表面點(diǎn)的相互作用類型(共五種，分別為脂肪、氫鍵供體、氫鍵受體、芳香面和芳香邊)。研究工作使用176個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練，使用18個(gè)含鋅酶進(jìn)行測(cè)試。這些含鋅酶中的16個(gè)，其配體結(jié)合口袋被正確識(shí)別。這也說明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以用于結(jié)合位點(diǎn)的分類，也可應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定。

1.4.2.4　盲對(duì)接

盲對(duì)接是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)接工具應(yīng)用到整個(gè)蛋白質(zhì)的過程。這一過程隱含著結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)能力，同時(shí)還能提供正確的配體結(jié)合方向相關(guān)信息。盲對(duì)接的使用前提是配體結(jié)構(gòu)為已知，而其他的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具沒有這個(gè)條件限制。但是，盲對(duì)接速度很慢，尤其是當(dāng)使用配體來篩選大量蛋白質(zhì)的時(shí)候。因此，盲對(duì)接最有用的場(chǎng)景為兩個(gè)結(jié)合分子(受體和配體)結(jié)構(gòu)均為已知，而用戶試圖找出一種生物相關(guān)的結(jié)合模式。

Hetenyi和van der Spoel[65]用AutoDock[66]進(jìn)行了盲對(duì)接并成功復(fù)現(xiàn)了八個(gè)復(fù)合體的蛋白-配體取向。盲對(duì)接項(xiàng)目已經(jīng)被加入到了CASP2對(duì)接競(jìng)賽[67]中。CASP2提出了挑戰(zhàn)問題是：給予配體和蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，確定其中配體的結(jié)合位置。九個(gè)小組提交了七個(gè)蛋白-配體復(fù)合體和一個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合體。這次競(jìng)賽項(xiàng)目的預(yù)測(cè)整體效果較好，提交的77個(gè)預(yù)測(cè)中，幾乎所有的構(gòu)象都在實(shí)際取向的3?范圍之內(nèi)。因此，盡管這種對(duì)接模擬速度慢，但其結(jié)果對(duì)于識(shí)別生物結(jié)合模式似乎是有所助益的。

1.4.2.5　應(yīng)用要點(diǎn)

結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別對(duì)于虛擬配體篩選和基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)非常重要。它限制搜索空間于蛋白復(fù)合物的相關(guān)部分，加快了這一進(jìn)程，減少了假陽性結(jié)果。功能位點(diǎn)定位對(duì)于從結(jié)構(gòu)到功能也是極為重要的。當(dāng)進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)時(shí)，如果對(duì)接前沒有關(guān)于配體結(jié)合位點(diǎn)或功能的信息，最好使用幾種不同類型的可用工具同時(shí)預(yù)測(cè)虛擬篩選靶標(biāo)的配體結(jié)合位點(diǎn)。另外，以口袋檢測(cè)和能量為基礎(chǔ)的方法也可為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)確定合適的搜索空間。