3.4　免疫檢測技術在食品安全中的應用

免疫檢測最初是應用在臨床醫學上的，現其在食品安全的檢測領域也獲得了廣泛應用，幾乎覆蓋了所有的食品安全領域。

食品中有害微生物及其毒素的免疫檢測：

根據食品中有害微生物及其毒素的不同，其針對的免疫檢測方法也不同，而且幾乎所有的免疫學方法都可以用于食源性有害微生物的檢測與鑒定，其中常用的方法主要包括乳膠凝集法、免疫擴散法、ELISA法、免疫磁珠法以及免疫沉淀法等。下面以對致瀉性大腸埃希氏菌腸毒素以及禽流感病毒的快速免疫檢測為例來說明免疫分析技術在食品有害微生物及其毒素檢測中的應用。

（1）間接抗原競爭ELISA法檢測致瀉性大腸埃希氏菌腸毒素

①原理　微孔板包被致瀉性大腸埃希氏菌腸毒素抗原，加入待測樣品和針對致瀉性大腸埃希氏菌腸毒素的單克隆抗體，固相的毒素與樣品中的毒素競爭性結合單克隆抗體，沒有與固相抗原結合的單克隆抗體和游離的樣品毒素在洗滌步驟中被除去，再加入酶標記的兔抗鼠Ig與固相上的單克隆抗體結合，將底物（鄰苯二胺）加入到孔中孵育，加入反應終止液終止反應后，在492nm處測量吸光度值，吸光度值與大腸埃希氏菌腸毒素濃度的自然對數成反比。

②產毒培養　將菌株和陽性及陰性對照菌株分別接種于0.6mL CAYE培養基內，37℃振蕩培養過夜。加入20000IU/mL的多黏菌素B 0.05mL，于37℃離心1h，分離上清液，加入0.1％硫柳汞0.05mL，于4℃保存待用。

③ST檢測法

a.包被　先在包被用ST抗原管中加入0.5 mL包被液，混勻后全部吸出于1.6mL包被液中混勻，以每孔50μL 加入40孔聚苯乙烯軟反應板中。加液后輕輕敲板，使液體布滿孔底。第一孔留空作對照，置4℃冰箱濕盒中過夜。

b.洗板　用洗板液Ⅰ洗3次。

c.封閉　每孔分別加入100μL封閉液，37℃水浴1h。

d.洗板　用洗板液Ⅱ洗3次，操作同上。

e.加樣品及ST單克隆抗體　每孔分別加實驗菌株產毒培養液50μL，稀釋的單克隆抗體50μL（先在ST單克隆抗體管中加0.5mL稀釋液，混勻后全部吸出于1.6mL稀釋液中，混勻備用），37℃水浴1h。

f.洗板　用洗滌液Ⅱ洗3次，操作同上。

g.加酶標記兔抗鼠Ig復合物　先在加酶標記兔抗鼠Ig復合物管中加0.5mL稀釋液，混勻后全部吸出于3.6mL稀釋液中混勻，每孔加100μL，37℃水浴1h。

h.洗板　用洗滌液Ⅱ洗3次，操作同上。

i.酶底物反應　每孔（包括第一孔）各加基質液100μL，室溫下避光5～10min，再加入終止液50μL。

j.結果判斷　以酶標記儀在波長492nm下測定吸光度（OD）值：

結果為陽性。

（2）斑點金免疫色譜測定法快速檢測禽流感病毒

①原理　將與禽流感病毒相對應的多克隆抗體固定于斑點金免疫色譜試紙條的檢測帶上，用膠體金標記與禽流感病毒相對應的單克隆抗體，并干燥于試紙條的金標墊上，再將羊抗鼠IgG固定于檢測帶后方的質控帶上。檢測時，將待測樣品加于樣品墊上后，樣品由于毛細管擴散作用向前移動，首先經過金標墊并水化干燥的膠體金標記物。樣品中的禽流感病毒與被膠體金標記的單克隆抗體發生特異性結合后，繼續向前移動到達檢測帶，此時被間接標記的禽流感病毒再次與檢測帶上的多克隆抗體發生特異性結合，從而使免疫復合物被富集或截留在檢測帶上，使檢測帶呈現紅色。未與禽流感病毒結合的金標抗體繼續色譜分離至質控帶與羊抗鼠IgG發生特異性結合，同樣使質控帶呈現紅色。通過肉眼判斷檢測帶與質控帶的顯色情況，可判斷樣品是否為陽性。

②膠體金的制備　制備直徑為10nm的膠體金。

③膠體金標記抗體　用膠體金標記抗禽流感病毒的單克隆抗體（鼠源）。

④膠體金免疫色譜測定法檢測試紙條的組裝　將兔抗禽流感病毒的高免血清（多抗）用XYZ3000平臺系統噴涂于硝酸纖維膜上反應區（C區）位置，在離反應區5mm處（D區）噴涂抗抗體（羊抗鼠IgG），此為質控區，噴涂后室溫干燥2h。將金標抗體噴涂在玻璃纖維上（構成膠金墊），室溫干燥2h。將樣品墊、膠金墊和吸水紙依次組裝在塑料底板上（圖3-7），這樣便完成快速檢測試紙條的組裝。

⑤檢測樣品　試紙條檢測卡平放，將樣品滴加到檢測卡的樣本墊上（A區），5min內觀察結果。如果反應區及質控區上均出現紅色條帶，說明樣品呈陽性，如果反應區上沒有出現紅色條帶，僅質控區上出現紅色條帶，說明樣品呈陰性。