3.3　免疫檢測原理

3.3.1　抗原-抗體反應(yīng)

3.3.1.1　抗原-抗體反應(yīng)的原理

抗原-抗體反應(yīng)（antigen-antibody reaction），即抗原與抗體之間的特異性反應(yīng)，可發(fā)生在體內(nèi)，也可發(fā)生在體外。在進(jìn)行體外免疫學(xué)實驗時，通常是以存在于血清中的抗體為材料進(jìn)行的，所以體外免疫學(xué)反應(yīng)也稱為血清學(xué)反應(yīng)（serologic reaction）。抗原與抗體的特異性結(jié)合是以抗原決定簇和抗體分子抗原結(jié)合部位之間的直接接觸為基礎(chǔ)的，其過程以非共價鍵提供主要的結(jié)合能量，包括非極性氨基酸側(cè)鏈之間的疏水鍵、帶有不同電荷的氨基酸殘基側(cè)鏈之間的離子鍵、相反極性電子云團(tuán)之間的范德華力和不同原子間的氫鍵等，其中，最主要的是疏水鍵。

抗體（Ab）與大多數(shù)抗原（Ag）都是蛋白質(zhì)。它們?nèi)苡谒行纬傻鞍踪|(zhì)溶液，其分子表面有許多親水基團(tuán)，所以抗體、抗原的水溶液是親水性膠體溶液，一般比較穩(wěn)定，不會自然沉淀。當(dāng)抗原與特異性抗體發(fā)生結(jié)合時，由于電荷減少或消失，而使它們由親水膠體變成疏水膠體，甚至形成肉眼可見的抗原-抗體復(fù)合物。抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)可以分為兩個階段：第一個階段是抗原與抗體的特異性結(jié)合階段，形成肉眼看不見的沉淀和凝集，這個過程很快，一般可在幾秒鐘內(nèi)完成；第二個階段為抗原與抗體間的可見反應(yīng)，當(dāng)抗原與抗體特異性結(jié)合后，在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)、溫度和pH值等作用下，可促使抗原-抗體復(fù)合物由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體，進(jìn)而凝聚成更大的、可見的抗原-抗體復(fù)合物。

抗原-抗體的反應(yīng)過程：

3.3.1.2　抗原-抗體反應(yīng)的特點

（1）特異性　抗原-抗體反應(yīng)的最大特點是特異性。如上文所述，抗體的特異性是由抗原的特異性決定簇產(chǎn)生的，抗原-抗體反應(yīng)實際上是抗原決定簇和抗體的超變區(qū)之間的結(jié)合，由于它們兩者之間的化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上高度互補(bǔ)，所以決定了它們之間反應(yīng)的特異性。但如果兩種不同的抗原分子上有共同的或相似的抗原決定簇，就可能與彼此相應(yīng)的抗體發(fā)生結(jié)合，即交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)對抗原-抗體反應(yīng)試驗的結(jié)果分析有干擾作用。因此，抗原-抗體反應(yīng)使用的已知抗原或已知抗體需要鑒定和提純，以確保試驗的準(zhǔn)確性。

（2）可逆性　抗原與抗體結(jié)合成復(fù)合物后，在一定條件下又可解離為游離的抗原與抗體的特性稱為抗原-抗體結(jié)合的可逆性。抗原-抗體的結(jié)合實際上是一個動態(tài)平衡的過程，其反應(yīng)式為：

其反應(yīng)平衡常數(shù)：

式中，［Ab］是抗體結(jié)合部位的濃度；［Ag］是抗原決定簇的濃度；［Ag·Ab］是二者結(jié)合物的濃度。K值可反映抗原-抗體之間的親和力。親和力高的抗體與抗原在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不容易解離；反之，親和力低的抗原-抗體復(fù)合物較易解離。另外，許多環(huán)境因素如電解質(zhì)的種類與濃度、pH值和溫度等，都會影響抗原-抗體的結(jié)合。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性，因此可用親和色譜法來提純抗原或抗體。

（3）比例性　比例性是指抗原-抗體特異性結(jié)合時，生成肉眼可見結(jié)合物的量與反應(yīng)物（抗原與抗體）濃度的關(guān)系。只有當(dāng)抗原-抗體的濃度比例適當(dāng)時，抗原-抗體才能出現(xiàn)最強(qiáng)的反應(yīng)，通常表現(xiàn)為沉淀最多或吸光度最大等現(xiàn)象。抗原或抗體任何一方的濃度過高或過低都會影響它們的反應(yīng)。在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物（沉淀）的量見圖3-1。曲線的高峰部分是抗原-抗體濃度比例最合適的范圍，稱為等價帶（zone of equivalence）。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成，在免疫測定中稱為帶現(xiàn)象（zone phenomenon）。抗體過量稱為前帶（prezone），抗原過量稱為后帶（postzone）。

抗原-抗體的比例性可用格子學(xué)說（lattice theory）進(jìn)行解釋。由于大多數(shù)天然抗原是多價的（即有多個抗原決定簇），而大多數(shù)抗體如IgG是二價的（即含有兩個超變區(qū)，能結(jié)合兩個相同的抗原決定簇），當(dāng)抗原和相應(yīng)的抗體數(shù)量比例適當(dāng)時，抗體分子如IgG的兩個超變區(qū)可分別結(jié)合兩個相同的抗原分子，并相互交叉連接成網(wǎng)格狀復(fù)合物，從而形成肉眼可見的沉淀。而當(dāng)抗原或抗體過剩時，由于結(jié)合點不能相互飽和，所以只能形成小的沉淀或可溶性的抗原-抗體復(fù)合物。

3.3.2　免疫檢測方法

3.3.2.1　免疫檢測方法的分類

免疫檢測方法種類很多，分類方法也有很多種。根據(jù)抗原（抗體）是否有被標(biāo)記可分為標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)、免疫沉淀反應(yīng)和免疫凝集反應(yīng)。標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)（labeled immunological technique）是指抗原（抗體）被酶、同位素或熒光素等標(biāo)記（連接）后與相應(yīng)的抗體（抗原）反應(yīng)，通過測定酶催化反應(yīng)生成的產(chǎn)物量、同位素的放射性強(qiáng)度或熒光素產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度來計算抗原-抗體的結(jié)合量，進(jìn)而計算出待檢測物質(zhì)（抗原或抗體）量的方法。根據(jù)標(biāo)記物的不同，標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)又可分為酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)、放射標(biāo)記免疫分析技術(shù)和熒光標(biāo)記免疫分析技術(shù)等三種。免疫沉淀反應(yīng)（immunological precipitation reaction）是將可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適量的電解質(zhì)存在條件下發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物并出現(xiàn)肉眼可見的沉淀或混濁，在固體載體中這種沉淀表現(xiàn)為沉淀線，在液體中則常表現(xiàn)為絮狀物或使液體混濁。免疫凝集反應(yīng)（immunological agglutination reaction）是將顆粒抗原（如細(xì)菌、血紅細(xì)胞）或可溶性抗原（抗體）結(jié)合于不溶性的載體微粒上后與相應(yīng)的抗體（抗原）反應(yīng)，在適當(dāng)條件下經(jīng)一定時間后凝集成肉眼可見的凝聚物。標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)主要用于定量免疫檢測，而凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)則多為定性分析方法。

根據(jù)免疫分析過程的反應(yīng)狀態(tài)還可把免疫學(xué)技術(shù)分為均相免疫學(xué)方法（homogeneous immunoassay）和非均相免疫學(xué)方法（heterogeneous immunoassay）。均相免疫學(xué)方法無需將反應(yīng)后抗原-抗體復(fù)合物與游離的抗原、抗體分開，一般在較短時間內(nèi)可以得到分析結(jié)果，操作比較簡便，但是通常靈敏度較低，一般僅適合于定性分析；非均相免疫學(xué)方法抗原-抗體復(fù)合物與游離的抗原、抗體以及雜質(zhì)等物質(zhì)分開，程序比較復(fù)雜，操作時間長，但是由于去除了游離抗原、抗體分子以及一些雜質(zhì)的干擾，因此靈敏度和特異性都比較高，適合于定量分析。

3.3.2.2　常用免疫檢測技術(shù)簡介

根據(jù)分類標(biāo)準(zhǔn)的不同可以將免疫檢測方法分為很多種，如前面所說的標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)、凝集反應(yīng)和沉淀反應(yīng)等等，這些技術(shù)還可以進(jìn)一步進(jìn)行分類。本節(jié)就這些技術(shù)中常用于食品安全檢測中的幾種進(jìn)行介紹。

（1）酶聯(lián)免疫吸附檢測

①基本原理　酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）是在免疫酶技術(shù)（immunoenzymatic technique）的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。其基本原理是抗體（抗原）與酶結(jié)合后，仍然能和相應(yīng)的抗原（抗體）發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，將待測樣品事先吸附在固相載體表面稱為包被；加入酶標(biāo)抗體（抗原），酶標(biāo)抗體（抗原）與吸附在固相載體上的相應(yīng)的抗原（抗體）發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物，不能被緩沖液洗掉；當(dāng)加入酶的底物時，底物與酶發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色，根據(jù)顯色的程度而對標(biāo)本中抗原（抗體）進(jìn)行定性或定量的分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。

②ELISA的種類　ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent）；酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為“結(jié)合物”（conjugate）；酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的情況以及檢測的具體條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。ELISA常用的方法主要有以下幾種類型：

a.夾心法　有雙抗體夾心法（圖3-2）和雙抗原夾心法兩種。兩者步驟基本相同，但酶標(biāo)記物和檢測對象不同。雙抗體夾心法測抗原的操作步驟如下：

ⅰ.將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

ⅱ.加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)。標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。

ⅲ.加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān)。

ⅳ.加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色測定得標(biāo)本中抗原的量。

雙抗原夾心法測抗體的反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似，不同之處是用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測相應(yīng)的抗體。

b.間接法　是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法（圖3-3）。其操作步驟如下：

ⅰ.將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

ⅱ.加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成分在洗滌過程中被洗去。

ⅲ.加酶標(biāo)抗抗體。可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測IgG抗體固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)二抗結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量成正相關(guān)。

ⅳ.加底物顯色。

c.競爭法　此法可用于抗原與半抗原的定量測定，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，其操作步驟如下：

ⅰ.將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

ⅱ.加入固定量的待測抗原和特異性酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)，使固相抗原與待測抗原二者競爭性結(jié)合酶標(biāo)抗體，經(jīng)洗滌除去游離的抗原、抗體及抗原-抗體復(fù)合物等。結(jié)合于固相抗原上的抗體與待測抗原含量成負(fù)相關(guān)，即：待測抗原濃度越高，與待測抗原結(jié)合的抗體越多，與固相抗原結(jié)合的抗體越少；待測抗原濃度越低，與待測抗原結(jié)合的抗體越少，與固相抗原結(jié)合的抗體越多。

ⅲ.加底物顯色。

d.捕獲法　在臨床檢驗中測定抗體IgM時多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷，如甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測。

③ELISA的技術(shù)要點

a.固相載體　用于吸附抗體與抗原，是ELISA中必不可少的工具。常用的有聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯和聚丙烯酰胺等，目前最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯板的要求：

ⅰ.具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，且不影響蛋白質(zhì)的免疫活性；

ⅱ.空白值低，孔底透明度高；

ⅲ.不同板和同一板各孔間性能基本一致。

b.包被　將抗原（抗體）固相化的過程稱為包被（coating）。常用的聚苯乙烯酶標(biāo)反應(yīng)板的包被方法：將抗原（抗體）溶于50mmol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液，加于酶標(biāo)反應(yīng)板孔中，4℃包被過夜或37℃包被2～6h，經(jīng)清洗后可用。包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。

c.封閉　繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程是封閉（blocking）。抗原或抗體包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的步驟與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05％～0.5％牛血清白蛋白，也有用10％小牛血清或1％明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度使用（5％）。

d.最佳工作濃度的選定　ELISA反應(yīng)試劑多，其工作濃度不同對結(jié)果影響較大。因此，必須對包被抗原（抗體）和酶標(biāo)抗體（抗原）進(jìn)行最佳工作濃度的滴定和選擇，以達(dá)到最佳的測定條件。

（2）膠體金免疫色譜　膠體金免疫技術(shù)是指以膠體金為標(biāo)記物，應(yīng)用于抗原-抗體反應(yīng)的一種新型標(biāo)記免疫檢測技術(shù)。這里的膠體金（colloidal gold）即金的水溶液，它有一般膠體溶液的特性。膠體金溶液的制備是利用凝聚法，主要是通過還原法，即在氯金酸溶液中加入還原劑如過氧化氫、磷、甲醛、苯肼等，使之聚合成為特定大小的金顆粒，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液。因為膠體金離子的表面具有吸附蛋白質(zhì)的能力，故可以通過非共價鍵的形式吸附蛋白質(zhì)抗原或抗體，實現(xiàn)對抗原或抗體的標(biāo)記。金膠體還具有高電子高密度的特性，可在顯微鏡下觀察到黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而常被用于定性或半定量的快速免疫檢測中。

膠體金免疫色譜技術(shù)（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）則是一種將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測技術(shù)和色譜分離技術(shù)等多種方法有機(jī)結(jié)合起來的固相標(biāo)記免疫檢測技術(shù)。其基本原理是以條狀纖維色譜材料作為固相，將與待測物（抗原或抗體）相對應(yīng)的抗體（抗原）固定于膜的其中一個區(qū)域（檢測帶），將膠體金標(biāo)記物吸附于纖維的金標(biāo)墊上，其一邊與樣品墊相連，一邊與檢測帶相連（圖3-4）。檢測時，將待測樣品加于樣品墊上后，樣品由于毛細(xì)管擴(kuò)散作用向前移動，首先經(jīng)過金標(biāo)墊并水化干燥的膠體金標(biāo)記物。樣品中的待測物與被膠體金標(biāo)記的抗體（抗原）發(fā)生特異性結(jié)合后，繼續(xù)向前移動到達(dá)檢測帶，此時被間接標(biāo)記的待測物再次與檢測帶上的抗體（抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，從而使免疫復(fù)合物被富集或截留在檢測帶上，通過可目測的膠體金而得到直觀的試驗現(xiàn)象（顯色）。

膠體金免疫色譜技術(shù)的反應(yīng)模式一般有三種，包括夾心法、間接法和競爭抑制法。監(jiān)測未知抗原常采用雙抗體夾心法和競爭抑制法，監(jiān)測未知抗體采用雙抗原夾心法和間接法。下面以雙抗體夾心法測抗原為例說明其反應(yīng)原理。此方法是在纖維膜上包被待測物相應(yīng)的抗體，同時用膠體金標(biāo)記相應(yīng)抗體。如果樣品為陽性，則樣品中的抗原先和被膠體金標(biāo)記的抗體免疫結(jié)合，到達(dá)檢測線位置時，復(fù)合物又和固定在纖維膜上的抗體免疫結(jié)合，檢測線形成可見的紅色線。多余的金標(biāo)記抗體繼續(xù)進(jìn)行色譜分離到檢測線后的控制線，與相應(yīng)的兔抗鼠二抗結(jié)合，控制線形成可見的紅色線。如果樣品為陰性，只有控制線形成可見的紅色線。當(dāng)檢測線與控制線均不出現(xiàn)紅色時，說明試紙條失敗。

目前，膠體金免疫色譜技術(shù)主要應(yīng)用于妊娠檢測、病原體抗原或抗體檢測、疾病相關(guān)蛋白檢測以及動物疫病診斷中。該技術(shù)擁有簡便、快速、特異、靈敏等優(yōu)點，具有巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。

（3）熒光偏振免疫檢測　熒光免疫技術(shù)是以熒光物質(zhì)標(biāo)記的特異性抗體或抗原作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于相應(yīng)抗原或抗體的分析鑒定和定量測定，是將抗原-抗體反應(yīng)的特異性與熒光物質(zhì)測定的敏感性和直觀性結(jié)合起來的一種免疫分析技術(shù)。

熒光偏振免疫測定（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA）是熒光免疫技術(shù)的其中一類。它是一種均相競爭熒光免疫分析法。其基本原理如下：熒光素經(jīng)偏振光照射后會躍入激發(fā)態(tài)，在回復(fù)至基態(tài)后可釋放光子，經(jīng)偏振儀形成偏振熒光。熒光偏振強(qiáng)度與熒光分子的大小成正比，與熒光物質(zhì)受激發(fā)時分子轉(zhuǎn)動速度成反比（圖3-5）。如熒光標(biāo)記的抗原由于分子量小，在溶液中的轉(zhuǎn)動速度快，熒光偏振強(qiáng)度小；當(dāng)熒光標(biāo)記抗原與特異性抗體結(jié)合后，其免疫復(fù)合物分子量大，在溶液中轉(zhuǎn)動速度變慢，熒光偏振強(qiáng)度就變大。FPIA就是利用檢測熒光標(biāo)記抗原在結(jié)合特異性抗體前后熒光偏振強(qiáng)度的變化，用競爭性方法間接測定溶液中小分子的含量。

例如運(yùn)用FPIA法檢測藥物濃度時，首先用異硫氰酸熒光素對小分子藥物進(jìn)行標(biāo)記，然后將熒光素標(biāo)記的小分子藥物、可能含有待測藥物的樣品溶液以及該小分子藥物的特異性抗體混合。若樣品溶液中待測未標(biāo)記的小分子藥物濃度低，則標(biāo)記的藥物分子與抗體結(jié)合的就多，由于抗體分子體積大，所形成的熒光素標(biāo)記的藥物分子與抗體的結(jié)合物體積亦大，旋轉(zhuǎn)慢，熒光偏振值高；若樣品溶液中小分子藥物濃度高，其將會與標(biāo)記的藥物分子競爭與抗體結(jié)合，以游離形式存在的標(biāo)記藥物增多，則熒光偏振強(qiáng)度就小。利用這一原理，用標(biāo)記藥物的濃度與對應(yīng)的熒光偏振值做工作曲線，便可進(jìn)行定量分析。另外，F(xiàn)PIA方法不僅能檢測抗原，也能對抗體進(jìn)行檢測。

FPIA是均相的競爭免疫分析方法，反應(yīng)系統(tǒng)完全在溶液中，不需要分離結(jié)合的和未結(jié)合的抗體。實驗過程非常簡單，僅僅是將抗體、熒光標(biāo)記抗原和抗原（即被測藥物）加入到反應(yīng)杯中，經(jīng)過幾分鐘甚至是幾秒鐘的溫育便可直接測量，可很快得到被測藥物的濃度。這是FPIA區(qū)別于其他免疫分析方法的最大優(yōu)勢。

（4）放射免疫檢測　放射免疫分析（radio immunoassay，RIA）是以放射性核素為標(biāo)記物的標(biāo)記免疫分析法。由于標(biāo)記物放射性核素的檢測靈敏度高，本法的靈敏度可高達(dá)ng甚至pg水平，因此常用于測定受檢樣品中的微量物質(zhì)，是靈敏度最高的微量檢測技術(shù)。

放射性核素是指原子核能自發(fā)地產(chǎn)生成分或能級的改變，然后變成另一種核素，變化時伴有射線的發(fā)射。放射性核素依衰變方式分為α、β、γ三種，用于放射性標(biāo)記的有β、γ兩類；目前常用的是γ型放射性核素，如¹²⁵I、¹³¹I等，以¹²⁵I最常用。標(biāo)記¹²⁵I的方法可分為兩大類，即直接標(biāo)記法和間接標(biāo)記法。直接標(biāo)記法是將¹²⁵I直接結(jié)合在蛋白質(zhì)側(cè)鏈的酪氨酸殘基苯環(huán)上，形成單碘酪氨酸或雙碘酪氨酸，操作簡便，結(jié)合效率高，但只能標(biāo)記含酪氨酸的化合物；間接標(biāo)記法則是將放射性碘連接到一個小分子載體上，再將這個小分子載體與蛋白質(zhì)結(jié)合。

放射免疫測定法可分為兩大類，即液相放射免疫測定和固相放射免疫測定。

液相放射性免疫測定屬于非均相競爭性標(biāo)記免疫檢測，其基本原理是用放射性核素標(biāo)記抗原（Ag*），使其與待測標(biāo)本中的抗原（Ag）競爭結(jié)合有限量的特異性抗體（Ab），并形成可溶性的抗原-抗體復(fù)合物Ag-Ab和Ag*-Ab，直到達(dá)到平衡。由于標(biāo)記抗原與特異性抗體的量是固定的，故 Ag*-Ab形成的量就隨著待測抗原的量而改變。待測抗原量增加，相應(yīng)結(jié)合的抗體多，從而抑制標(biāo)記抗原對抗體的結(jié)合，使Ag*-Ab相應(yīng)減少，游離的標(biāo)記抗原相應(yīng)增加，即抗原-抗體復(fù)合物中的放射性強(qiáng)度與受檢標(biāo)本中抗原的濃度呈反比。反應(yīng)平衡后，向反應(yīng)體系中加入沉淀劑聚乙二醇，使Ag*-Ab復(fù)合物完全沉淀，以完成與游離標(biāo)記抗原的分離。分離后分別測出結(jié)合態(tài)標(biāo)記抗原（B）與游離態(tài)標(biāo)記抗原（F）的放射性強(qiáng)度（脈沖數(shù)），即可計算出B/F值。用一系列不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行反應(yīng)，計算相應(yīng)的B/F值，可以繪制出一條劑量-反應(yīng)曲線。受檢標(biāo)本在同樣條件下進(jìn)行測定，計算B/F值，即可在劑量-反應(yīng)曲線上查出標(biāo)本中抗原的含量。

固相放射免疫測定是將抗體吸附在固相載體上的免疫檢測方法，分競爭性和非競爭性。競爭性分為單層競爭法、多層競爭法，非競爭性又分為單層非競爭法和多層非競爭法。

①單層競爭法　預(yù)先將抗體連接在載體上，加入標(biāo)記抗原（Ag*）和待測抗原（Ag）時，二者競爭與固相載體上的抗體結(jié)合。若固相抗體和Ag*的量不變，則加入的Ag量越多，B/F值越小。根據(jù)這種函數(shù)關(guān)系，則可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

②雙層競爭法　先將抗原與載體結(jié)合，然后加入抗體與抗原結(jié)合，載體上的放射量與待測濃度成反比。此法較繁雜，有時重復(fù)性差。

③單層非競爭法　先將待測物與固相載體結(jié)合，然后加入過量相對應(yīng)的標(biāo)記物，經(jīng)反應(yīng)后，洗去游離標(biāo)記物測放射量，即可算出待測物濃度。本法可用于測抗原、抗體，方法簡單，但干擾因素較多。

④雙層非競爭法　預(yù)先制備固相抗體，加入待測抗原使之結(jié)合成固相抗體-抗原復(fù)合物，然后加入過量的標(biāo)記抗體，與上述復(fù)合物形成抗體-抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物，洗去游離抗體，測放射量，便可測算出待測物的濃度（圖3-6）。此法與ELISA的雙抗體夾心法相似。

放射免疫檢測技術(shù)對所測樣品的前處理要求簡單，多數(shù)樣品可直接用于測試。目前，研制成功了許多檢測試劑。運(yùn)用這一技術(shù)開展了對食品農(nóng)藥殘留的生物技術(shù)檢測研究，對水產(chǎn)品、肉類產(chǎn)品、果蔬產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行監(jiān)測。