3.2　抗體的制備方法

3.2.1　多克隆抗體的制備

多克隆抗體（polyclonal antibody）是抗原或抗原與佐劑的混合物按一定程序直接免疫試驗動物后獲得的抗血清（antiserum）。由于抗血清中的抗體是由不同的抗原決定簇刺激不同的B淋巴細胞克隆產生的抗體混合物，所以稱為多克隆抗體。多克隆抗體由于具有制備過程簡單、操作容易、生產成本低、無需特殊的儀器設備等優勢，目前在很多實驗室仍為制備抗體的首選方法。

多克隆抗體的制備包括了實驗動物的選擇、抗原的處理、動物免疫以及抗血清的采集、純化和鑒定等步驟。

（1）實驗動物的選擇　在多克隆抗體生產中應用最多的動物一般為鼠、兔和羊。在選擇實驗動物時，首先應考慮抗原的來源和免疫動物的親緣關系。如上一節所述，兩者的親緣關系越遠，其引起的免疫應答越強烈，產生的抗體效價越高，反之抗體的效價越低。實驗動物的年齡、營養狀態等生理特性對抗體的產生也有密切的關系。一般應選擇年齡適中，無疾病，營養狀況良好的動物進行免疫，這樣得到的抗體效果更好。另外，選擇實驗動物時還應考慮血清的用量，如需要量大，可選擇山羊等大動物，一般實驗室試驗，選擇兔和鼠即可。應注意的是，在注射抗原前，應采集少量動物血清（陰性血清）和抗原進行血清學反應，選擇不和抗原反應的動物進行免疫。

（2）抗原的處理　主要包括抗原的分離提純、半抗原的改造以及抗原與佐劑的混合等。

抗原的純度與所制備的抗血清的質量至關重要。如果用純度不夠的抗原免疫動物，就很可能使之產生混合的抗體，最終導致交叉反應，從而影響分析方法的正確性。對于從生物體中提取的免疫原，含有多種復雜成分，純化過程就顯得特別重要。不同的免疫原要求不同的純化方法，綜合起來有鹽析法、Sephadex柱分離法、離子交換柱色譜、親和色譜、電泳等方法。

半抗原分子量小，無免疫原性。若想用半抗原進行免疫，首先要將半抗原與一定的載體連接起來，將其改造成完全抗原后，才可對動物進行免疫。蛋白質是一種高分子膠體兩性化合物，一般來說，任何蛋白質都具有很強的免疫原性，并且很容易和半抗原結合，因此，蛋白質是半抗原連接首選的優良載體。

在注射抗原時，往往先將抗原與等體積的佐劑（adjuvant）混合成乳狀液后再進行注射。所謂佐劑泛指能提高針對某一種注入體內的免疫原而產生免疫反應的任何物質。目前，動物實驗中最常用的佐劑為弗氏佐劑（Freund adjuvant）。它又分為完全弗氏佐劑（complete Freund adjuvant）和不完全弗氏佐劑（incomplete Freund adjuvant）。與佐劑混合后，能使抗原緩慢釋放至淋巴系統中，同時擴大了抗原面積，從而增強了抗原的免疫原性。一般來說，實驗動物首次注射抗原時，抗原與完全弗氏佐劑混合，而在加強注射時則與不完全弗氏佐劑混合。

（3）動物的免疫　動物免疫過程中應綜合考慮的因素包括抗原的免疫劑量、注射途徑以及加強免疫的時間和次數。

抗原的劑量應根據抗原的免疫原性強弱、動物的種類和大小等因素確定。抗原的注射量與抗原的免疫原性成反比，與免疫動物的大小成正比。對于大多數動物來說，免疫全過程所需的最佳抗原量在0.1～1.0mg/kg體重的范圍。抗原的注射途徑有很多，包括肌內、靜脈、脾臟、皮下、淋巴結和腹腔注射等。一般地，腹腔、肌內、皮下注射適合于任何抗原，這些途徑主要通過刺激局部淋巴結發生免疫應答，初次免疫和加強免疫都可以使用。靜脈注射只適用于可溶性抗原和分散的單細胞懸液，其誘發的免疫應答主要發生在脾臟。

為了得到高效價的抗體，在首次免疫后進行多次的加強免疫非常重要。兩次免疫注射的時間間隔因動物的大小和抗原的種類不同而不同。通常情況下，小動物的免疫間隔時間為10～14d，大動物為2個月左右。如果免疫原是半抗原，則免疫間隔時間應更長，這主要是因為半抗原分子量較小，難以在短時間內引起免疫反應。

（4）抗血清的采集、保存、純化與鑒定　當動物經2～3次免疫后，可通過靜脈取血，檢測抗血清的效價。如果抗體的效價達到理想的水平后，可將動物殺死，通過摘除眼球法、心臟取血等方法獲得血液。將血液放置于室溫或4℃下凝血，即可獲得抗血清。向抗血清中加入0.1％～0.2％的NaN₃后，保存于4℃冰箱中，可存放3個月到半年，效價不會損失。

對于獲得的抗血清要對其進行效價、親和力以及交叉反應等參數的測定。效價（titer）是指抗血清或抗體仍能產生可觀察到的標準免疫反應時的稀釋度。如抗血清的效價為1:1000，即抗血清稀釋1000倍時仍能產生可觀察到的免疫反應。可見，效價是評價抗血清檢測靈敏度的一項重要指標。親和力（affinity）是表示抗原和抗體結合程度的一項指標，可通過抗原-抗體反應的平衡常數K來表示。交叉反應是衡量抗體特異性的一項重要指標。如果抗體交叉反應程度大，很可能是由于抗原不純所造成的。交叉反應太大的抗體在免疫檢測中無應用價值。

3.2.2　單克隆抗體的制備

抗體主要由B淋巴細胞合成。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系，每個B淋巴細胞對應與一種抗原決定簇結合，并產生一種相應的抗體。當機體受抗原刺激后，不同的B淋巴細胞分裂增殖，克隆合成多種抗體，即為多克隆抗體。如果能從不同的B淋巴細胞中選出一個制造一種專一抗體的細胞進行培養，就可以由單細胞經分裂增殖而形成細胞群，即單克隆細胞。該單克隆細胞將合成針對一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體（monoclonal antibody）。

單克隆抗體的制備過程非常復雜，可分為：融合脾細胞和骨髓瘤細胞制備雜交瘤細胞、雜交瘤細胞的選擇性培養、雜交瘤細胞的篩選與克隆化、單克隆抗體的大量生產以及性質的鑒定。

（1）制備雜交瘤細胞　正常小鼠用抗原免疫后，其脾臟等淋巴組織含大量能分泌特異性抗體的B淋巴細胞。但這些細胞在體外最多只能存活10～20d，因而無法產生大量的特異性抗體。但實驗發現，小鼠的骨髓瘤細胞卻可以在體外長期存活并大量繁殖。將經免疫的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞以聚乙二醇（PEG）作為融合劑，進行細胞融合，產生的雜交瘤細胞既具有骨髓瘤細胞的無限繁殖能力，又具有B淋巴細胞的遺傳信息，能分泌特異性抗體。通過制備這種雜交瘤細胞能實現單克隆抗體的大量生產。

（2）雜交瘤細胞的選擇性培養　將脾細胞和骨髓瘤細胞融合，一般只能產生少量的雜交瘤細胞，更多的為未雜交的脾細胞和瘤細胞、脾細胞與脾細胞的雜交細胞以及瘤細胞與瘤細胞的雜交細胞。因此要對融合處理后的細胞進行選擇性培養，使非目標細胞死亡，只有由脾細胞與骨髓瘤細胞形成的雜交瘤細胞存活并繁殖。在這里使用的選擇性培養基為HAT選擇性培養基，在這種培養基下只有目標雜交瘤細胞可以通過正常代謝合成DNA，并大量生長繁殖，而其他細胞將因為無法正常合成DNA或在體外不能長期存活而死亡。

（3）雜交瘤細胞的篩選與克隆化　雜交瘤細胞的篩選與克隆化一般在細胞融合后10d后進行。它是單克隆抗體制備中非常重要的一步。這是因為，一些初生的雜交瘤細胞不穩定，可能丟失染色體，喪失產生抗體的能力，所以需要克隆不斷清除變異細胞；融合后的雜交瘤細胞不一定都是所需的目的細胞，需要通過克隆來純化和確證；在液氮中長期保存的能分泌特異性抗體的雜交瘤細胞也有喪失分泌抗體的可能，故需通過細胞的不斷克隆以純化目的細胞。篩選克隆細胞的方法包括有限稀釋法、顯微操作法、半固體培養法和熒光激活細胞分選儀法等。

（4）單克隆抗體的大量生產以及性質的鑒定　獲得高純度的雜交瘤細胞后可進行單克隆抗體的大量生產。其生產的方法大體分為體內產生法和體外產生法。體內產生法是指用健康的雌鼠，最好采用曾多次生產過的雌鼠經注射腹水癌誘發劑后接種雜交瘤細胞以生產腹水抗體的方法；體外產生法是指在玻璃或塑料培養瓶中培養雜交瘤細胞，從培養上清液中提取抗體的方法。一般來說，比起體外法，體內產生法具有抗體濃度高、分泌抗體的能力穩定、生產成本較低等優點。

獲得單克隆抗體后，和多克隆抗體一樣，也需要對其效價、親和力以及交叉反應進行分析。另外，還需要對免疫球蛋白的類和亞類以及結合位點等進行分析。

3.2.3　重組抗體

3.2.3.1　重組抗體的概念

在抗體研究的漫長過程中，相繼發展了三代不同水平的抗體制備技術。其中以抗原免疫高等脊椎動物制備的多克隆抗體，稱為第一代抗體；通過雜交瘤技術生產的只針對某一種特定抗原決定簇的單克隆抗體，稱為第二代抗體；應用DNA重組技術和蛋白質工程技術按人們的意愿在基因水平上對抗體分子進行切割、拼接或修飾，重新組裝成新型抗體分子，稱為重組抗體或基因工程抗體，即第三代抗體。

Kohler等于1975年創立的B淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術，使抗體技術的研究和應用有了重大突破。由此制備出的單克隆抗體是抗單個抗原決定簇的抗體，具有高度的特異性和均一性，且能大量制備。以抗體為載體偶聯放射性同位素、毒素和藥物的導向藥物或“生物導彈”曾風靡全球。但經過了近十余年的研究和臨床試驗，人們發現這些“導彈”藥物離真正的應用還有一段距離。其存在的問題主要有：①鼠源性抗體用于人體后產生人抗鼠抗體（HAMA反應）；②由于鼠單抗是異源蛋白，在體內很快被清除；③由于抗體分子量較大，抗體分子到達靶部位的量不足；④抗體本身的效應功能不強等，這使得傳統單克隆抗體技術制備的抗體在應用上受到了極大的制約，無法充分發揮其在疾病防控方面的作用。在20世紀80年代中期出現新技術將免疫球蛋白的基因結構和功能同DNA重組技術結合起來，再將重組后的免疫球蛋白分子基因導入細胞進行表達。由該技術所得的抗體去除或減少了無關結構，保留（或增加）了天然抗體的特異性和生物學活性，降低或基本消除抗體的免疫原性，減低抗體中鼠源成分的同時還可保留原有抗體的特異性。因此，基因工程抗體比天然抗體具有更廣闊的應用前景。

3.2.3.2　重組抗體的發展現狀

（1）鼠單抗的人源化　針對鼠抗體用于人體后產生HAMA反應，影響靶向性和療效，以及異源蛋白在人體內被很快清除的問題，可利用分子生物學手段和技術進行鼠抗體的人源化。目前人源化的方法主要有以下三種：

①鼠單抗恒定區的人源化　抗體分子是雙功能分子，其與抗原特異性結合的活性存在于輕鏈和重鏈的可變區，即Fv段，抗體分子作為異種蛋白誘發免疫反應的抗原性則主要存在于恒定區，因此可將鼠單抗的可變區與人抗體的恒定區進行拼接形成嵌合抗體。這樣做可消除大部分鼠異源性，并能夠保留親本鼠單抗結合抗原的特異性和親和力。目前已批準在臨床用于治療非何杰金氏淋巴瘤的Rituximab就屬于此類抗體。

②鼠單抗可變區的人源化　嵌合抗體僅將恒定區換成了人源性，但其仍會保留著30％左右的鼠源序列，可引起不同程度的HAMA。為了降低嵌合抗體的免疫原性，使嵌合抗體更加人源化，產生了CDR嫁接技術（CDR grafting）。抗體分子輕、重鏈可變區的6個互補決定區（complementarity determinative region，CDR）形成CDR平面直接接觸抗原，決定了抗體的特異性，骨架區只是作為支持CDR的支架，而且其立體構象極為保守。因此，將鼠單抗的CDR移植到人單抗的骨架區上，有可能使人單抗獲得鼠單抗的特異性，并最大限度地減少鼠單抗的異源性，僅有9％的序列來源于親本鼠單抗，這種CDR移植的人單抗也稱為改型抗體。

③表面氨基酸殘基的人源化　雖然改型抗體的人源化程度可超過90％，但要保留親本抗體的特性有一定困難，因為抗體與抗原結合時，雖然可變區的CRD起很大作用，但抗體骨架區的結構也會通過與CRD相互作用影響分子結構，因此成功的例子不多。近年來計算機建模技術的發展和蛋白質晶體結構數據的不斷增加，使表面氨基酸殘基“人源化”技術有可能用于抗體的人源化改造。不同種屬間免疫球蛋白的CDR長度雖不一致，但暴露于表面的氨基酸殘基的位置和數量卻很保守。這些表面殘基的組成模式在種系內相當保守，而種系間互不相同，這種差異是免疫原性的來源。將鼠輕、重鏈可變區組成的Fv段表面暴露的骨架區氨基酸殘基中與人Fv不同者改為人抗體中的氨基酸，可使Fv的表面殘基人源化。表面殘基人源化后的鼠單抗保留了親本抗體的特異性和親和力，降低了免疫原性。

（2）小分子抗體　抗體分子的抗原結合部位局限在可變區組成的Fv段，從而可以構建分子量較小的具有抗原結合功能的分子片段，稱為小分子抗體。小分子抗體具有分子量小、穿透性強、免疫原性低、半衰期短等特點，目前研究較多和比較有實用前景的有以下幾種：

①Fab片段　Fab片段由重鏈Fd段和完整的輕鏈組成，二者通過一個鏈間二硫鍵連接，形成異二聚體，是完整抗體分子的1/3，僅有一個抗原結合位點。利用基因工程的方法，將重鏈Fd基因與輕鏈基因5’端接上細菌蛋白的信號序列（signal sequence），所表達的蛋白質在細菌信號肽的引導下可分泌到周質腔，信號肽被信號肽酶（signal piptidase）所裂解，生成的Fd段與輕鏈的周質腔內完成立體折疊和鏈內、鏈間二硫鍵，形成異二聚體，成為有功能的Fab段。該抗體僅為IgG的1/3，且沒有Fc段，免疫原性低，具有良好的穿透力，常用作導向藥物的載體和顯影。

②單鏈抗體（ScFv）　在DNA水平上將輕、重鏈可變區基因用一段適當的寡聚核苷酸（接頭）連起來，使之表達成為一條單一的肽鏈，稱為單鏈抗體。該抗體大小僅為完整IgG的1/6，同時抗原結合位點沒有發生變化，因此保留了完整的結合特異性。基于這一優勢，ScFv具有更好的組織穿透力，能夠進入一般抗體無法到達的部位，在臨床應用及疾病治療中能夠得到更好的應用。另外，單鏈抗體擁有多肽接頭，可根據需要設計為具有特殊功能的位點，如金屬螯合、連接毒素或藥物等，可用于影像和臨床治療。

③雙特異性抗體　應用基因工程與化學偶聯技術，把識別不同抗原的兩種抗體的編碼序列進行重新排列，生產出可同時與兩種抗原作特異性結合的新型重組抗體，即雙特異性單克隆抗體。在這種抗體中，兩條臂分別識別兩種不同的抗原，其中一個特異性指向體內的效應系統，另一個特異性結合靶抗原，將激活的生物效應橋連于治療靶標，達到治療目的。目前其應用的主要目標是腫瘤，其次在感染性疾病研究方面也展示了誘人的前景。

除了以上所介紹的鼠抗體人源性技術和小分子抗體技術之外，重組抗體技術還包括噬菌體抗體庫技術、轉基因動植物生產抗體技術、核糖體展示技術和mRNA展示技術等。這些技術均使制備抗體變得簡單便捷、穩定廉價，為大規模的應用提供了良好的基礎。隨著分子生物學和免疫學技術的不斷發展，基因工程抗體技術將在疾病預防、診斷及治療上得到越來越多的應用，這可為提高人類生活質量提供強有力的支持。