2.3　酶抑制法快速檢測(cè)技術(shù)的構(gòu)建

基于膽堿酯酶抑制法原理設(shè)計(jì)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要包括速測(cè)卡法（試紙片法）、比色法和酶?jìng)鞲衅鞣ā?/p>

酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留的靈敏度與使用的酶、顯色反應(yīng)以及反應(yīng)時(shí)間、溫度等有密切關(guān)系。無論采用何種具體檢測(cè)方法，酶是其中決定檢測(cè)方法靈敏度和可靠性的最關(guān)鍵因子，酶的種類決定了檢測(cè)的靈敏度和方法的可靠性。

2.3.1　酶制劑的種類和制備

酶抑制法測(cè)定農(nóng)藥殘留所用的酶包括乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶和植物酯酶。前兩種來自于動(dòng)物體內(nèi)，故也稱作動(dòng)物酯酶。

（1）膽堿酯酶的種類

①乙酰膽堿酯酶　乙酰膽堿酯酶是有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的最適反應(yīng)底物，其活性能夠?qū)Ｒ恍缘乇挥袡C(jī)磷和氨基甲酸酯類藥劑所抑制，用其檢測(cè)這兩類藥劑比用丁酰膽堿酯酶和植物酯酶具有明顯的專一性和可靠性，檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性率也明顯降低。

乙酰膽堿酯酶的主要來源包括動(dòng)物器官（如昆蟲頭部和肝臟）以及動(dòng)物血液（如馬血清）等，以由家蠅頭部獲取的乙酰膽堿酯酶活性最高。來自昆蟲頭部的乙酰膽堿酯酶存在原料不易獲取、含量低、不是單一分子型、純化困難、穩(wěn)定性差、成本高等不足，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前殘留檢測(cè)的需求。針對(duì)此問題，學(xué)者們廣泛開展了不同來源的乙酰膽堿酯酶活性篩選研究，以期獲得廉價(jià)易得、酶活性較高、易分離純化的乙酰膽堿酯酶。

余孝穎（1996）用酶電極研究了有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)3種不同來源的乙酰膽堿酯酶選擇性抑制的情況，結(jié)果表明家蠅中的乙酰膽堿酯酶對(duì)敵敵畏的抑制最敏感，電鰩次之，雞肝最弱。

張慧君等（2004）研究了4種農(nóng)藥對(duì)雞肝酶和電鰻乙酰膽堿酯酶的總酯酶活力以及乙酰膽堿酯酶活力的抑制靈敏度，發(fā)現(xiàn)雞肝總酯酶活力與電鰻乙酰膽堿酯酶活力受農(nóng)藥的抑制靈敏度相近，并且雞肝總酯酶活力在檢測(cè)農(nóng)殘時(shí)，可獲得更低的農(nóng)藥含量檢出限，除馬拉硫磷外均低于國(guó)家規(guī)定的最大農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，以測(cè)總酯酶活力的方法替代測(cè)乙酰膽堿酯酶活力的方法，同樣可以達(dá)到快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的目的，而且雞肝酶具有提取簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)。

②丁酰膽堿酯酶　丁酰膽堿酯酶主要來自動(dòng)物血清，是乙酰膽堿酯酶的替代品。與乙酰膽堿酯酶檢測(cè)結(jié)果相比，用丁酰膽堿酯酶檢測(cè)農(nóng)藥殘留存在著專一性和可靠性低、檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性率高等問題。

李穎暢等（2013）采用驢血清中的丁酰膽堿酯酶作為酶源，對(duì)不同的有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)條件和方法進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，樂果、敵百蟲、敵敵畏、馬拉硫磷對(duì)驢血清丁酰膽堿酯酶（BChE）的IC₅₀分別為0.094mg/mL、0.179mg/mL、0.124mg/mL、0.0078mg/mL，驢血清BChE對(duì)這4種有機(jī)磷農(nóng)藥?kù)`敏度的大小順序?yàn)椋厚R拉硫磷>樂果>敵敵畏>敵百蟲。樂果、敵敵畏對(duì)丁酰膽堿酯酶的最佳抑制時(shí)間為15min；敵百蟲、馬拉硫磷對(duì)丁酰膽堿酯酶的最佳抑制時(shí)間為20min。

李維等（2014）以馬血清丁酰膽堿酯酶為對(duì)照，以碘化硫代丁酰膽堿為底物，采用Ellman法，研究了雞血清丁酰膽堿酯酶的酶學(xué)性質(zhì)及其對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種BChE在35℃、pH8.0時(shí)都達(dá)到最佳的反應(yīng)活性，無底物抑制效應(yīng)，對(duì)毒扁豆堿敏感，對(duì)鹽酸多奈哌齊相對(duì)不敏感；雞血清BChE對(duì)敵百蟲、克百威、滅多威、速滅威、敵敵畏的IC₅₀值分別為0.77μmol/L、31.99μmol/L、1.14μmol/L、5.49μmol/L、0.95μmol/L；馬血清BChE對(duì)這五種農(nóng)藥的IC₅₀值分別為3.88μmol/L、1.22μmol/L、22.58μmol/L、24.18μmol/L、5.46μmol/L。除克百威外，雞血清BChE對(duì)供試農(nóng)藥的敏感性均高于馬血清BChE。因此，雞血清BChE具有較好的農(nóng)藥敏感性，可以作為農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的候選酶源。

③植物酯酶　農(nóng)藥對(duì)植物酯酶也具有抑制作用，由于植物酯酶具有酶源豐富、取材方便、制備簡(jiǎn)單、成本低、不需要低溫保存且保質(zhì)期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因此采用植物酯酶用于測(cè)定農(nóng)藥殘留是一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用的方法。

在植物酯酶中，小麥酯酶對(duì)農(nóng)藥較為敏感，但是，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)不同小麥品種的酯酶對(duì)農(nóng)藥的敏感度不一樣。肖建軍等（2002）和徐斐等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，豫麥39對(duì)農(nóng)藥樂果最敏感，豫麥18最不敏感，因此為了準(zhǔn)確、定量測(cè)定農(nóng)藥殘留量，必須選定一種對(duì)農(nóng)藥較為敏感的小麥作為酶源。這些學(xué)者還認(rèn)為，對(duì)于同一品種小麥，產(chǎn)地不同和種植方法不同時(shí)，小麥酯酶對(duì)農(nóng)藥的敏感度的差異是否在容許的范圍內(nèi)，需要作進(jìn)一步的研究，以確定可以進(jìn)行定量分析而且具有互換性的植物酯酶酶源。

張寧（2006）的研究顯示，玉米酯酶的活力遠(yuǎn)低于小麥酯酶的活力，不適于用來檢測(cè)農(nóng)藥殘留。

（2）膽堿酯酶的制備　當(dāng)前，膽堿酯酶的制備主要是直接從動(dòng)物的組織或血液中提取。從動(dòng)物組織或血液提取的粗酶液中除了有ChE外，還有其他多種酶類存在，其中一些酶是解毒酶，能夠催化水解農(nóng)藥，也有一些酯酶能夠作為ChE的替代靶標(biāo)，起到保護(hù)ChE的作用，這會(huì)顯著影響ChE的動(dòng)力學(xué)特性；此外，生物體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶并不是單一分子型，據(jù)研究表明，黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）其體內(nèi)的AChE主要是以疏水型的二聚體形式存在的；另?yè)?jù)研究表明，馬鈴薯甲蟲（Leplinotarsa decemlineata）體內(nèi)的AChE存在形式主要有2種，其中一種是約占92％的親水型二聚體，另外一種是約占8％的兩性單體；不同分子型的乙酰膽堿酯酶因結(jié)構(gòu)上的差異具有對(duì)農(nóng)藥不同的選擇性和靈敏度；因此，有必要對(duì)粗酶提取液進(jìn)行分離、純化，從而提高檢測(cè)的靈敏度和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

AChE作為一種羧酸水解酶類，它的分離純化是應(yīng)用蛋白質(zhì)分離純化的方法，分為初級(jí)純化和液相色譜純化。初級(jí)純化方法主要有：離心沉淀、鹽析、超濾、透析、低溫有機(jī)溶劑沉淀、變性沉淀等。液相色譜純化方法主要有：凝膠色譜、離子交換、親和色譜等。為了使酶蛋白的純化效果大大提高，常常需要聯(lián)合使用多種技術(shù)。但是，在聯(lián)合使用多種純化技術(shù)時(shí)，由于增加了操作的步驟，易造成對(duì)溫度敏感的AChE酶活的損失。

Lund等（2000）使用硫酸銨分級(jí)沉淀和Sephadex G-200色譜從鰈魚的肌肉中純化到了膽堿酯酶，提純倍數(shù)為2000倍。彭霞等（2008）聯(lián)合采用Sephadex G-25、DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-200對(duì)家蠶頭部的AChE進(jìn)行了純化。賈玉玲等（2010）報(bào)道了從鯽魚腦中提取和純化AChE的方法，用預(yù)冷的含0.1％ Triton-X 100 PBS緩沖液（pH 8.0，0.1mol/L），冰浴條件下勻漿（勻漿比為1:4），勻漿液4℃離心（13000r/min）30min，將上清液用（NH₄）₂SO₄（最佳濃度為40％）進(jìn)行鹽析，然后再進(jìn)行4℃過夜透析（袋外為pH7.4、20mol/L Tris-HCl），最后用Sephadex G-100色譜純化，實(shí)驗(yàn)得到了高活性較純的AChE，酶活達(dá)到458.43μmol/（min·mg）。

親和色譜具有高度的專一性，純化步驟簡(jiǎn)單，純化效率高。親和色譜技術(shù)正在被應(yīng)用于分離純化AChE。與前面的幾種純化技術(shù)相比，簡(jiǎn)化了純化步驟，減少誘發(fā)敏感性蛋白在純化過程中理化性質(zhì)發(fā)生變化的程度，提高了純化的效率。朱小山等（2006）用親和柱純化鲅魚的AChE，純化倍數(shù)為415倍。魏輝等人（2009）采用CEA親和色譜純化家蠅AChE，純化倍數(shù)為672倍。

2.3.2　酶法速測(cè)卡（紙片法）

速測(cè)卡法是將敏感生物的膽堿酯酶和乙酰膽堿類似物2，6-二氯靛酚乙酸酯分別經(jīng)固化處理后加載到濾紙片上，在膽堿酯酶的催化作用下，2，6-二氯靛酚乙酸酯發(fā)生水解反應(yīng)，生成藍(lán)色的靛酚和乙酸。如果樣品中含有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，膽堿酯酶便會(huì)與其結(jié)合，失去催化靛酚乙酸酯水解的能力。因此，該方法只需通過觀察最終的反應(yīng)體系中有沒有藍(lán)色出現(xiàn)就可判斷出所測(cè)樣品中是否含有農(nóng)藥殘留，即，如果有藍(lán)色產(chǎn)生表示樣品中沒有農(nóng)藥殘留，如果呈現(xiàn)淺藍(lán)色或白色則表示樣品中含有農(nóng)藥殘留。

衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所等7家單位的實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（朱赫等，2014），速測(cè)卡法（紙片法）對(duì)常用農(nóng)藥的檢出限為0.3～3.5mg/kg（王林等，2003），均高出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥殘留限量，因此在使用速測(cè)卡檢驗(yàn)蔬菜樣品為陽(yáng)性時(shí)，即可視為有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥已超標(biāo)。該方法檢出時(shí)間為15～30min，對(duì)超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)允許殘留量或違禁使用的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的有效檢出率可達(dá)80％以上。該方法不需儀器，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，成本低，特別適用于現(xiàn)場(chǎng)對(duì)大批量樣品的篩查。國(guó)內(nèi)企業(yè)利用該法原理生產(chǎn)的商品化速測(cè)卡和農(nóng)藥殘留速測(cè)箱都屬于速測(cè)卡法。

速測(cè)卡法既能直接進(jìn)行測(cè)定，也能配合專用儀器使用。直接測(cè)定是利用體溫加熱藥片，無需專用儀器。配合配套儀器使用，一次性可以同時(shí)測(cè)定9～12個(gè)樣品，由于儀器保證了溫度的要求，測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確。現(xiàn)國(guó)內(nèi)蔬菜生產(chǎn)基地、各大果蔬批發(fā)市場(chǎng)、超市都已將果蔬農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)卡（配套儀器）作為農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)篩查的工具。

當(dāng)前對(duì)于紙片法的研究，主要集中在酶的固定化、酶的載體以及顯色劑的選擇等方面，以期通過對(duì)這些因素的研究來生產(chǎn)出實(shí)用、性能好的酶片。

（1）固定化酶　許娟等（2008）通過對(duì)酶用量、戊二醛濃度、牛血清蛋白濃度、固定化pH值和溫度的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了NC膜固定化植物酯酶的方法。Wei等（2005）以戊二醛為交聯(lián)劑、牛血清蛋白（BSA）為保護(hù)劑，將乙酰膽堿酯酶（AChE）交聯(lián)固定到商品載體上，制備固定化酶。

（2）顯色劑的選擇　劉海霞等（2003）和劉文君等（2007）通過兩種不同顯色劑（2，6-二氯靛酚乙酸酯和固藍(lán)B鹽）的顯色原理及性能對(duì)比實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了采用2，6-二氯靛酚乙酸酯既兼顧了底物和顯色劑雙重作用，又具有底物穩(wěn)定性好、靈敏、簡(jiǎn)便實(shí)用的特點(diǎn)。

2.3.3　酶抑制分光光度法（比色法）

酶抑制分光光度法的原理與農(nóng)藥速測(cè)卡法的原理相同，區(qū)別僅在于后者是在試紙上反應(yīng)，而前者是在溶液中反應(yīng)。將待測(cè)樣品提取液與敏感生物中提取的膽堿酯酶作用，以乙酰膽堿的類似物碘化硫代乙酰膽堿或碘化硫代丁酰膽堿等為底物，以5，5′-二硫代-2，2′二硝基苯甲酸（DTNB）等為顯色劑，膽堿酯酶催化底物水解，水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)，用分光光度計(jì)在特定波長(zhǎng)下比色，根據(jù)吸光度隨時(shí)間的變化，計(jì)算農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制率或直接利用吸光度，判斷樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量是否超標(biāo)（黃文風(fēng)等，2000；張春霞等，2010）。

該法所用的酶可以是來自動(dòng)物的膽堿酯酶［包括乙酰膽堿酯酶（AChE）和丁酰膽堿酯酶（BChE）］，也可以是植物酯酶。GB/T 5009.199—2003推薦使用AChE，NY/T 448—2001推薦使用BChE，GB/T 18630—2002推薦使用小麥酯酶。因所用的酶不同，底物和顯色劑也有所不同，表2-1列出了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)各自的推薦用酶、所用底物、顯色劑以及檢測(cè)波長(zhǎng)的比較。

相比于速測(cè)卡法，比色法具有更高的靈敏度，檢出限一般在0.05～5.00mg/kg，檢出時(shí)間為30min，對(duì)超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)允許殘留量或違禁使用的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的有效檢出率可達(dá)80％以上。國(guó)內(nèi)企業(yè)按GB/T 5009.199—2003或NY/T 448—2001對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行了改裝，使之適合比色法檢測(cè)要求。目前，常用國(guó)產(chǎn)農(nóng)藥殘留速測(cè)儀均為多通道光路設(shè)計(jì)，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品，直接顯示檢測(cè)結(jié)果，還帶有數(shù)據(jù)接口，通過數(shù)據(jù)管理軟件上傳檢測(cè)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享和網(wǎng)上傳輸，自動(dòng)化程度較高，是目前各省市和縣區(qū)質(zhì)檢監(jiān)督部門日常檢測(cè)的主要速測(cè)儀器。

但是比色法也存在一定的缺點(diǎn)，比如所用的膽堿酯酶易失活，檢測(cè)時(shí)需要控制的條件較多，易受溫度影響等；且該方法僅限于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并不適合現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。

該領(lǐng)域的研究方向主要集中在優(yōu)化酶促反應(yīng)的條件，選擇合適的顯色劑、底物以及如何消除檢測(cè)樣品中葉綠體等的干擾等。

（1）酶反應(yīng)最佳條件　酶是一種生物催化劑，其反應(yīng)速度受反應(yīng)溫度和時(shí)間、pH值、酶和底物的濃度、環(huán)境中離子、酶抑制劑等因素的影響（杜美紅等，2010）。

李順等（2007）研究了抑制時(shí)間、抑制溫度、底物加入量和酶液加入量4個(gè)因素對(duì)檢測(cè)條件的影響，通過正交試驗(yàn)和極差分析，得出4因素的主次關(guān)系為抑制時(shí)間>底物量>酶液量>溫度，確定了蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的最佳檢測(cè)條件為：抑制時(shí)間15min，抑制溫度35℃，底物加入量100μL，酶液加入量100μL。

王文祥等（2006）研究了磷酸緩沖液pH值、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物、酶用量對(duì)兔血清AChE活力測(cè)定的影響，結(jié)果表明，供試AChE的最佳活力條件是：磷酸緩沖液（pH8.0）3.0mL，0.6％二硫雙對(duì)硝基苯甲酸顯色劑50μL，0.75％酶液（pH8.0）100μL，反應(yīng)溫度35℃。混勻穩(wěn)定后加入1％碘化硫代乙酰膽堿底物50μL，反應(yīng)180s后在波長(zhǎng)412nm處測(cè)定吸光度。在上述條件下，有機(jī)磷殺蟲劑丙硫磷濃度0.0125～0.4g/mL范圍內(nèi)，溫育時(shí)間5～30min，與AChE抑制率之間存在良好的相關(guān)性。

楊東鵬等（2004）提出了新的最適條件確定標(biāo)準(zhǔn)，即保證酶的活性保持在一定水平的基礎(chǔ)上（0.1333min^-1≤k₁≤2667min^-1），選擇抑制率（以甲胺磷為抑制劑）最高時(shí)的溫度和pH值作為最適條件。為此，確定了抑制時(shí)間為10min時(shí)的最適條件為：抑制溫度47.0℃，pH7.7。進(jìn)而在此最適條件下確定了新的檢測(cè)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)酶抑制率≥58％時(shí)，蔬菜中含有某種有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留為陽(yáng)性。

裘正軍等（2007）通過單因素對(duì)比試驗(yàn)研究了吸光度隨反應(yīng)時(shí)間的變化關(guān)系、溫度對(duì)酶活性的影響及農(nóng)藥殘留濃度與酶抑制率的關(guān)系，結(jié)果表明，吸光度隨反應(yīng)時(shí)間逐漸增加，反應(yīng)前期增速快，線性度好，適合測(cè)量；酶在20～40℃時(shí)具有最佳的活性，靈敏度高；農(nóng)藥殘留對(duì)酶的抑制作用明顯，當(dāng)抑制率高于70％時(shí)可判定農(nóng)藥殘留超標(biāo)。

（2）酶抑制所用底物　酶抑制劑顯色反應(yīng)可使用的底物和顯色劑很多，不同的酶與底物配合使用，其檢測(cè)限不盡相同。

侯學(xué)文等（2003）利用膽堿酯酶水解碘化酰膽堿后形成的硫代膽堿，與二硫雙對(duì)硝基苯甲酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物，在波長(zhǎng)412nm下測(cè)定，研究了酶和底物的添加量、保溫溫度和保溫時(shí)間對(duì)酶活力的影響，以及不同濃度與保溫時(shí)間的辛硫磷對(duì)膽堿酯酶活力的抑制情況，獲得了膽堿酯酶優(yōu)化的反應(yīng)條件。

宛梅丹等（2007）建立的乙酸靛酚酯-丁酰膽堿酯酶反應(yīng)體系比傳統(tǒng)的膽堿酯酶-碘化硫代乙酰膽堿法測(cè)定步驟更簡(jiǎn)便，保溫所需時(shí)間更短。

劉暢等（2009）以二次鹽析后的鴨血清丁酰膽堿酯酶（BChE）為農(nóng)藥殘留的檢測(cè)用酶，碘化硫代丁酰膽堿（BTChI）為底物，5，5′-二硫代-二硝基苯甲酸（DTNB）為顯色劑，410nm下比色測(cè)定吸光度變化，計(jì)算膽堿酯酶的抑制率，從而推算農(nóng)藥殘留情況。當(dāng)抑制率大于35％時(shí)，表明農(nóng)藥含量超標(biāo)。檢測(cè)過程只需20～40min，并可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。

（3）消除基質(zhì)干擾　除了有機(jī)磷和氨基甲酸酯類物質(zhì)對(duì)酶產(chǎn)生抑制作用外，食用植物中某些成分如氯代煙堿類似物質(zhì)對(duì)ChE也有抑制作用，因此檢測(cè)過程可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。此外，一些農(nóng)產(chǎn)品含有大量的葉綠素或其他色素，易對(duì)顯色造成干擾。

桑園園等（2009）選用實(shí)際檢測(cè)中易出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象的韭菜、蒜苗、蒜黃、大蒜4種蔬菜為材料，利用酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留，并對(duì)樣品前處理步驟進(jìn)行改進(jìn)，增加了對(duì)樣品提取液加熱處理，達(dá)到消除假陽(yáng)性的目的。結(jié)果表明，對(duì)樣品提取液進(jìn)行適當(dāng)加熱可以起到消除假陽(yáng)性的作用，且不會(huì)造成殘留農(nóng)藥的損失。蒜苗、蒜黃、大蒜、洋蔥的最佳處理溫度分別為110℃、100℃、120℃、80℃，在達(dá)到相應(yīng)最佳消除溫度后，假陽(yáng)性影響消失，且加熱時(shí)間對(duì)假陽(yáng)性影響不顯著。

鐘樹明等（2002）應(yīng)用植物酶抑制技術(shù)檢測(cè)蔬菜中的有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥。用小柱對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，可去除葉綠素的干擾，提高檢測(cè)靈敏度。

2.3.4　酶抑制傳感器

20世紀(jì)80年代以來，國(guó)際上農(nóng)藥殘留分析新技術(shù)的研究非常活躍，不斷有新方法、新技術(shù)涌現(xiàn)，生物傳感器（biosensor）法就是其中的一種。生物傳感器是由生物敏感部件與信號(hào)轉(zhuǎn)換器緊密配合，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目標(biāo)化合物的分析裝置。其基本原理是：傳感器中生物敏感部件與待測(cè)樣品中的目標(biāo)物發(fā)生特異性識(shí)別，發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生一些物理或化學(xué)信號(hào)（如熱、光、聲音、顏色、pH、電化學(xué)）的變化，這些不同的變化通過不同原理的信號(hào)轉(zhuǎn)換器（如熱學(xué)熱敏原件、光極光敏電阻、聲學(xué)壓電晶體、離子選擇電極等）的轉(zhuǎn)換，變成可以定量處理的電信號(hào)、光信號(hào)等，放大后顯示或記錄，就可對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性和定量檢測(cè)（Kumar等，2006；楊靚等，2012；劉永杰等，2004；楊海等，2005）。根據(jù)生物傳感器中生物敏感物質(zhì)的不同可分為酶生物傳感器、免疫生物傳感器和微生物傳感器等。其中的酶生物傳感器法是當(dāng)前農(nóng)藥殘留速測(cè)技術(shù)中的研究熱點(diǎn)之一。酶生物傳感器具有體積小、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、響應(yīng)快、可實(shí)現(xiàn)連續(xù)檢測(cè)及在線分析等優(yōu)點(diǎn)。

（1）酶生物傳感器的種類　酶生物傳感器是以酶為識(shí)別元件的一種傳感器，所采用的酶有抑制型的膽堿酯酶（乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶）和直接水解的有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶，其中被研究較多的是膽堿酯酶?jìng)鞲衅鳌?/p>

①膽堿酯酶生物傳感器　該生物傳感器的原理是基于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)ChE的抑制作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)。

根據(jù)所用分子識(shí)別元件的敏感材料的數(shù)量，膽堿酯酶生物傳感器有單酶、雙酶和三酶3種類型；根據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)換的原理不同，酶生物傳感器總體上又可分為電位式、電流式、光學(xué)式等3種類型（金盛燁，2004；朱赫等，2014）。其中，以電流式單酶?jìng)鞲衅餮芯繛樽疃啵浠驹硎菍hE固定在載體上，樣品中的有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)固定化酶膜上酶的活性產(chǎn)生抑制作用，使酶對(duì)底物水解反應(yīng)的速率和程度發(fā)生改變，電流頻率隨之發(fā)生變化，通過測(cè)定電流頻率判斷ChE被抑制的程度，從而對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)。

韓恩等（2014）利用海藻酸鈉將乙酰膽堿酯酶包埋固定在玻碳電極表面，以氯化硫代乙酰膽堿ATCl為底物，當(dāng)溶液中存在一定濃度的久效磷農(nóng)藥時(shí)，由于乙酰膽堿酯酶的活性受到抑制，從而導(dǎo)致傳感器對(duì)ATCl的響應(yīng)電流減小。根據(jù)該生物傳感器響應(yīng)電流的變化與農(nóng)藥濃度的關(guān)系實(shí)現(xiàn)對(duì)久效磷農(nóng)藥的快速檢測(cè)。在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，該傳感器對(duì)久效磷農(nóng)藥的線性檢測(cè)范圍為4.5～98.0ng/mL，檢測(cè)限為2.0ng/m L。伍周玲等人（2014）以雙醛纖維素（dialdehyde cellulose，DAC）為固載酶基質(zhì)材料，通過固定化酶化學(xué)鍵聯(lián)技術(shù)制備固定化乙酰膽堿酯酶（DAC-AChE），采用自組裝法制備多層殼聚糖/固定化乙酰膽堿酯酶/功能化碳納米管生物傳感器（Chi/DAC-AChE/F-CNTs/GCE），利用交流阻抗法、循環(huán)伏安法及差分脈沖伏安法考察新型傳感器對(duì)農(nóng)殘的檢測(cè)性能。結(jié)果顯示，新型傳感器對(duì)氨基甲酸酯殺蟲劑1-萘基-N-甲基氨基甲酸酯具有良好的響應(yīng)，檢測(cè)方法響應(yīng)快速，線性范圍寬，靈敏度高，最低檢出限可達(dá)3.5μg/L。

Mionetto等（1992）將ChE與膽堿氧化酶（ChOx）耦合構(gòu)建了電流式雙酶生物傳感器，對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)限可達(dá)到3×10^-11g/mL。Andreescu等（2002）將AChE與酪氨酸酶耦合，使用絲網(wǎng)印刷電極的電化學(xué)雙酶生物傳感器對(duì)毒死蜱和對(duì)氧磷的檢測(cè)限分別為5.2×10^-9g/mL和0.56×10^-9g/mL。干寧等（2008）將乙酸膽堿酯酶（AChE）及膽堿氧化酶（ChOx）固定于組裝在絲網(wǎng)印刷電極表面的Fe₃O₄/Au納米復(fù)合微粒上，構(gòu)建了雙酶?jìng)鞲衅鳎ˋChE-ChOx/Fe₃O₄/Au SPCEs），該雙酶?jìng)鞲衅麟娏黜憫?yīng)在乙酸膽堿濃度為0.5～12.5mmol/L之間呈良好線性關(guān)系（R²=0.998），其對(duì)克百威和敵敵畏的檢測(cè)范圍在0～1.00μg/mL之間均呈良好線性關(guān)系（R²=0.977），檢測(cè)限均可達(dá)0.01μg/mL，應(yīng)用于實(shí)際樣品白菜的添加回收率在95％～110％之間。

Karousos等（2002）則將過氧化物酶添加到AChE與酪氨酸酶耦合的雙酶系統(tǒng)中制成三酶生物傳感器，使用石英晶體微天平（QCM）可以檢測(cè)濃度低于1×10^-9g/mL的西維因和敵敵畏。

由于有機(jī)磷類農(nóng)藥能夠抑制抗壞血酸氧化酶的活性，Rekha等（2000）采用基于抗壞血酸氧化酶的安培型生物傳感器檢測(cè)乙基對(duì)氧磷，抗壞血酸的最佳底物濃度為5.67mmol/L，在1～10mg/L范圍內(nèi)酶底物反應(yīng)的抑制率與乙基對(duì)氧磷的濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9942。

②有機(jī)磷水解酶生物傳感器　有機(jī)磷水解酶生物傳感器的研究在深度和廣度上僅次于膽堿酯酶生物傳感器。通常，有機(jī)磷水解酶（OPH）能催化有機(jī)磷農(nóng)藥中P—O、P—S和P—CN鍵水解生成酸和醇，這些水解產(chǎn)物通常是電活性或光活性物質(zhì)，可以被轉(zhuǎn)換成可測(cè)量的電或光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥濃度的測(cè)定，這是有機(jī)磷水解酶生物傳感器的檢測(cè)原理。已開發(fā)出用OPH制成的電位（Mulchandani等，1999）、電流（Chough等，2002）、光學(xué)（Russel等，1999）等多種類型有機(jī)磷水解酶生物傳感器。然而，與膽堿酯酶生物傳感器相比，有機(jī)磷水解酶生物傳感器靈敏度較低即檢出限較高；而且，有機(jī)磷水解酶生物傳感器只能檢測(cè)部分有機(jī)磷化合物。目前OPH尚未商品化，主要原因是OPH在天然菌株中含量太低，難以大量生產(chǎn)，生產(chǎn)成本高昂，這是導(dǎo)致有機(jī)磷水解酶生物傳感器研發(fā)較晚和進(jìn)展較慢的重要原因。

（2）酶生物傳感器的研究?jī)?nèi)容　目前國(guó)內(nèi)外在酶生物傳感器方面的研究?jī)?nèi)容主要有酶的選擇、酶的固定化方法、電極材料的選擇及改良等。

①酶的選擇　目前用于生物傳感器的乙酰膽堿酯酶主要是從果蠅和電鰻中獲得的，也有利用雞和鯉魚提取的乙酸膽堿酯酶進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)研究。Tan等（2011）從家蠅中獲取AChE基因，采用定點(diǎn)突變的方法獲取A262G、Y327F、Y327D、I374D突變基因，利用畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果顯示這些突變體可以改善催化劑的活性并提高對(duì)殺蟲劑的敏感性，三重突變體GDD（A262G/Y327D/I374D）對(duì)滅多威、呋喃丹、毒死蜱、甲基對(duì)硫磷的敏感性均有顯著的提高。

②酶的固定化方法　酶生物傳感器技術(shù)的關(guān)鍵是酶的固定技術(shù)，主要包括酶的固定方法和固定酶的載體材料的選擇。酶的固定化是指以一定的固體材料為載體將其包埋起來，使酶仍具有催化活性并可回收及重復(fù)使用的方法。酶的固定化方法主要有吸附法、包埋法、共價(jià)法、交聯(lián)法等，近些年來也出現(xiàn)一些新的固定化技術(shù)如定向固定（即將酶的特定位點(diǎn)連在載體上，使酶按一定的方向排列在載體表面）、多酶共固等。

劉鸝等（2006）以戊二醛為交聯(lián)劑將丁酰膽堿酯酶交聯(lián)固定在ISFET電極的敏感柵極上來測(cè)定敵敵畏農(nóng)藥，最小檢出限可以達(dá)到10^-7mol/L。

王金梅等（2004）以海藻酸鈉為載體包埋固定乙酰膽堿酯酶，考察了影響酶固定化的重要因素，獲得了最佳固定化條件，制備的凝膠酶珠機(jī)械強(qiáng)度高，活力重現(xiàn)性好；在20g/L氯化鈣溶液中3℃下保存40d，活力基本不變。周祖新等（2007）以尼龍網(wǎng)為載體，分別用硫酸二甲酯和三乙基四氟化硼作烷基化試劑使尼龍網(wǎng)活化，利用共價(jià)鍵法將乙酰膽堿酯酶固定化，獲得了較好的固定化效果，酶膜活性分別達(dá)到4.2U/cm²和11.1U/cm²，固定化效率分別達(dá)到24.2％和64.1％，重現(xiàn)性好，穩(wěn)定性好，5個(gè)月后活性無明顯下降。

③電極材料的選擇及改良　乙酰膽堿酯酶?jìng)鞲衅鞯年P(guān)鍵在于生物膜電極的制備。生物膜電極由敏感膜和電化學(xué)轉(zhuǎn)換器兩部分構(gòu)成。隨著COPC、TCNQ、亞甲基藍(lán)、普魯士藍(lán)等各種電子傳遞媒介的引入，生物傳感器法測(cè)定的靈敏度越來越高。另外，納米修飾電極，例如納米金、納米線、碳納米管、Cds-石墨納米復(fù)合材料等，為生物傳感器提供了更具潛力的性能。通過使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）的傳感器輸出的數(shù)據(jù)分析與化學(xué)計(jì)量學(xué)的結(jié)合，可以分辨出農(nóng)藥種類并計(jì)算出濃度。

生物傳感器靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速，檢測(cè)樣品既不需要預(yù)處理，也不需要額外的試劑，樣品用量少，響應(yīng)快，并可反復(fù)使用，可以進(jìn)行連續(xù)在線檢測(cè)，容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化測(cè)量等。但是生物傳感器在檢測(cè)過程中的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和使用壽命等方面存在問題，并且當(dāng)前膽堿酯酶等生物材料在固定化過程中容易失活等問題還沒有得到很好的解決，這些因素影響了該技術(shù)的推廣使用。