第一節　微生物工業用菌種

一、工業微生物的特點

一個現代化的發酵工業必須具有優良的菌種、合適的工藝和先進的設備、嚴格的檢測與控制，其中菌種是主體，其他則是為了充分發揮菌種的優良性能而考慮和設計的。

能用于發酵生產的微生物即為工業微生物，它們具有個體小、種類多、繁殖快、分布廣、代謝能力強、易變異改造等特點。

二、發酵工業對菌種的要求

微生物廣泛分布于土壤、水和空氣等自然界中，資源非常豐富。目前認為，人類研究的微生物不足總數的10%。從自然界中分離出來的菌株有的可直接利用，有的則需要進行人工誘變，得到的突變體才能被利用。育種新技術的更新，不斷滿足新產品和原料轉換對新菌種的需求。

作為大規模生產的微生物工業用菌種，應盡可能滿足下列要求：

（1）菌種能在廉價原料制成的培養基上迅速生長和大量合成目的產物。

（2）菌種能在要求不高、易控制的培養條件（糖濃度、溫度、pH值、溶解氧、滲透壓等）下迅速生長和發酵，以縮短發酵周期。在天氣炎熱地區應選擇耐高溫菌種。

（3）根據代謝調控要求選擇高產菌株，如營養缺陷型菌株或調節突變型菌株。

（4）菌種抗噬菌體能力強，以防止感染噬菌體而造成“倒罐”現象的發生。

（5）菌種遺傳性狀穩定，不易退化，可保證發酵生產和產品質量的穩定性。

（6）菌種在發酵過程中產生的氣泡要少，提高裝料系數，提高單罐產量，降低成本。

（7）菌種對需要添加的前體物質有耐受能力，并且不能將這些前體作為一般碳源利用。

（8）菌種不是病原菌，同時在系統發育上與病原菌無關，不產生任何有害的生物活性物質和毒素，以保證產品的安全。

三、工業生產常用的微生物菌種

微生物在食品、藥品、水產、化工、紡織、石油、國防等工業上用途很廣。目前，微生物代謝產物的開發應用越來越多，已大規模工業化生產的有上百種，僅酶制劑工業就有四五十種。可見，微生物工業開發應用的潛力巨大。現介紹工業上常用的微生物，如表2-1所示。

四、發酵工業菌種的選育

一般來說，工業微生物可以從以下幾個途徑獲得：①向菌種保藏機構索取有關菌株，從中篩選所需菌株；②從自然界采集樣品，從中進行分離篩選；③從一些發酵制品中分離目的菌株。

（1）自然選育　一般程序是將菌種制成菌懸液，用稀釋法在固體平板上分離單菌落，再分別測定單菌落的生產能力，從中選出高水平菌種。

從自然界中分離篩選目的菌株的一般步驟如下：樣本采集→標本材料的預處理→富集培養→菌種初篩→菌種復篩→性能鑒定→菌種保藏。

（2）誘變育種　誘變育種是采用物理、化學誘變因素使微生物DNA上的堿基發生改變，而排列錯誤的DNA模板形成異常的遺傳信息，造成某些蛋白質結構變異，導致細胞功能的改變。

常用的誘變劑包括：物理誘變劑和化學誘變劑。

①物理因素　常用輻射誘變，α射線、β射線、γ射線、Χ射線、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發變異。

②化學因素　烷化劑、核酸堿基類似物等。

（3）雜交育種　一般是指人為利用真核微生物的有性生殖或準性生殖，或原核微生物的接合、F因子轉導等過程，促使兩個具有不同遺傳性狀的菌株發生基因重組，以獲得性能優良的生產菌株。

（4）代謝調控育種　代謝調控育種主要包括改變代謝通路的育種、改變自我代謝調節系統的育種。

（5）原生質體融合技術　原生質體融合技術是通過人工方法，使遺傳性狀不同的兩個細胞的原生質體發生融合，并產生重組子的過程，亦可稱為“細胞融合”。原生質體融合技術已廣泛運用于細菌、放線菌、霉菌和酵母的育種。

原生質體融合技術主要步驟包括：選擇菌株、原生質體制備、原生質體融合、融合體再生、篩選優良性狀的融合重組子。

（6）基因工程育種　某些物質本來在微生物體內是不能合成的，因為微生物缺少合成這些物質的基因，沒有合成這些物質的酶。隨著基因工程的發展，可由人工合成某種基因，或者由動物體內取出某種基因，經過加工剪接后再通過載體移入微生物體內，得到表達后，這種微生物就能合成該物質，例如人工胰島素等，這類微生物被稱為工程菌株。

基因工程育種主要是通過轉化、轉導、轉染、雜交等手段有目的地增加、增強或取消、減弱某個或某些基因，從而得到需要的工程菌株。

五、生產菌種的保藏

微生物工業生產與純種培養、菌種質量密切相關，而菌種質量又與菌種的制備和保藏直接相關，所以說菌種保藏是微生物工業生產的重要環節。菌種保藏的目的是保證菌種在長時間內盡可能保持原有菌株優良的生產性能，提高菌種的存活率，減少菌種的變異，以及不被雜菌污染以利于生產上長期使用。

菌種保藏的基本原理是根據菌種的生理、生化特點，創造條件使菌種的代謝活動處于不活潑狀態。在長期保藏菌種的實踐中人們采用了多種方法，以適應不同的微生物。雖然不同的菌種保藏方法各有優缺點，但其基本原則相同：選用優良純種和創造一個最有利于菌種休眠的環境，即微生物生長繁殖和代謝受抑制且不易突變的環境。這種環境要求干燥、低溫、缺氧、缺營養、有保護劑等。微生物工業菌種常用的保藏方法有：斜面低溫保藏法、石蠟油封保藏法、砂土保藏法、硅膠保藏法、冷凍干燥法、液氮超低溫凍結法等。菌種保藏的方法除了能長期保持菌種原有的優良性狀，還應簡便、經濟，能廣泛應用于工業生產。

菌種保藏注意事項：

（1）保藏的菌種要用良好的培養基，采用對數期種子；

（2）在保藏操作中，嚴格無菌操作，定期做無菌檢查；

（3）要注意保藏菌種的制備質量；

（4）為了防止菌種退化，在保藏期間，要為菌種創造最適宜的保藏條件；

（5）嚴格控制接代次數；

（6）保藏菌種恢復培養時，要移接到保藏以前所用的統一培養基上進行培養，以維持優良性能的穩定性。

六、防止菌株衰退的措施

菌種退化是指整個菌體在多次接種傳代過程中逐漸造成菌種發酵力（如糖、氮的消耗）或繁殖力（如孢子的產生）下降或發酵產物得率降低的現象。對此，首先要鑒定是否由于染菌引起產量下降或菌種生長延緩，可直接進行鏡檢判斷或采用劃線分離來確定是染菌還是菌種退化；其次要判斷是否由于培養條件引起暫時性變化，可通過培養幾批菌種觀察生長代謝情況來確定。

菌種退化的原因有兩方面：一是菌種保藏不妥；二是菌種生長的要求沒有得到滿足。例如，遇到某些不利的條件，或失去某些需要的條件，或誘變型新菌株發生回復突變而喪失新的特性。如果發現菌株已經發生退化，產量下降，則要進行分離復壯。因為在菌種發生衰退的時候，并不是所有的菌體都衰退，其中未衰退的菌體往往是經過環境考驗的、具有更強生命力的菌體。因此，采用單細胞菌株分離的措施，即用稀釋平板法或平板劃線法，以取得單細胞長成的菌落，再通過菌落和菌體的特征分析和性能測定，就可獲得具有原來性狀的菌株，甚至性狀更好的菌株。

對于某些菌種，還可配合其他辦法分離單細胞菌株，如芽孢桿菌，可先將菌液用沸水處理數分鐘，再用平板進行分離，從所剩的孢子中挑選出最優的菌體來。如果遇到某些菌株，即使進行單細胞分離仍不能達到復壯的效果，則可改變培養條件，以達到復壯的目的。同時，通過實驗選擇一種有利于高產菌株而不利于低產菌株的培養條件，能夠得到產量較高的菌株。如果將單菌落分離和一定的培養條件相結合進行復壯，則更為有效。因此產生退化現象的原因多為基因突變，所以使用誘變劑處理，對退化類型的菌株具有殺傷力，經誘變劑處理后再進行單菌落分離，就可得到復壯的菌株。同樣道理，其他不具誘變作用的物理和化學因素也可用于復壯處理，但需針對具體菌種進行具體分析，以選擇最佳的復壯方法。