第二節　種子擴大培養

一、種子擴大培養的目的與要求

現代發酵工業的生產規模越來越大，每只發酵罐的容積有幾十立方米甚至幾百立方米。若按5%～10%的接種量計算，就要接入幾立方米到幾十立方米的種子，這單靠試管里的種子直接接入是不可能達到必需的數量和質量的，必須從試管中的微生物菌種逐級擴大為生產使用的種子。菌種的擴大培養就是把保藏的菌種，即砂土管、冷凍干燥管中處于休眠狀態的生產菌種接入試管斜面活化，再經過錐形瓶和種子罐，逐級擴大培養后達到一定的數量和質量的純種培養過程。這些純種的培養物稱為種子。菌種種類不同，生產產品品種不同，其擴大培養的生產方法和生產條件均有所差別，如營養、溫度、酸堿度等條件。因此，菌種擴大培養的目的就是為每次發酵罐的投料提供相當數量的、代謝旺盛的種子。種子擴大培養要根據菌種的生理特性，選擇合適的培養條件來獲得代謝旺盛和數量足夠的種子。這種種子接入發酵罐后，會使發酵生產周期縮短，設備利用率提高，對雜菌的抵抗能力增加，對發酵生產起到了關鍵性的作用。對于不同產品的發酵過程來說，必須根據菌種生長繁殖速度的快慢決定種子擴大培養的級數。

二、種子擴大培養的制備流程

工業化生產中，種子制備的過程實際上就是種子逐步擴大培養的過程。種子的擴大培養是成功進行發酵生產的關鍵。對于不同的菌種，擴大培養的要求和工藝都不一樣。為生產低成本、高質量的產品，需要根據工業化生產需求制訂科學的擴大培養工藝，采用科學的手段對擴大培養的整個過程進行監測和控制。

種子制備包含兩個階段：實驗室種子制備階段和生產車間種子制備階段，如圖2-1所示。

（一）實驗室種子制備階段

實驗室種子制備一般采用孢子的制備和液體種子制備兩種方式。對那些產孢子能力強、孢子發芽生長繁殖快的菌種，可以采取在固體培養基上培養的方法，孢子可直接接入種子罐，從而簡化了操作，減少了操作步驟，同時也減少了染菌的機會。

1.孢子的制備

（1）細菌孢子的制備　細菌的斜面培養基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養溫度一般為37℃，培養時間一般為1～2d，產芽孢的細菌培養則需要5～10d。

（2）霉菌孢子的制備　霉菌孢子的培養一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品為培養基。培養溫度一般為25～28℃，培養時間一般為4～14d。例如生產青霉素的產黃青霉菌，采用大米或小米作為固體培養基，取一定量裝入250mL茄子瓶中進行滅菌，米粒含水量一定要控制好，米粒不能黏也不能散，滅菌冷卻后接入孢子懸浮液，在25～28℃培養4～14d。培養期間，還要經常翻動，保持通氣均勻。培養結束后，接入種子罐，或以真空抽去水分至10%以下，于4℃冰箱中保存備用。

（3）放線菌孢子的制備　放線菌孢子的培養一般采用瓊脂斜面培養基，培養基中含有一些適合產孢子的營養成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機鹽等。培養溫度一般為28℃，培養時間為5～14d。

2.液體種子制備

（1）好氧培養　對于產孢子能力不強或孢子發芽慢的菌種，可以用液體培養法，如產鏈霉素的灰色鏈霉菌、產卡那霉素的卡那鏈霉菌都采用搖瓶液體培養法。孢子接入含液體培養基的搖瓶中，在搖床上恒溫振蕩培養，生長出的菌絲體作為種子。其過程為：試管→錐形瓶→搖床→種子罐。

不產孢子的細菌，如生產谷氨酸的棒狀桿菌屬、短桿菌屬，以32℃培養18～24h的斜面移入250mL茄子瓶斜面培養基上，或在搖瓶培養基上，于32℃培養12h后可接入種子罐。

（2）厭氧培養　對于酵母菌（生產啤酒、葡萄酒等），其種子的制備過程為：試管→錐形瓶→卡氏罐→種子罐。

例如，生產啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂培養基斜面上，4℃冰箱保藏。3～4個月移種一次，再接種至10mL麥芽汁試管中，25～27℃保溫培養2～3d后，移至含250mL麥芽汁的500mL錐形瓶或含500mL麥芽汁的1000mL錐形瓶中。25℃培養2d，再移至含5～10L麥芽汁的卡氏罐中，15～20℃培養3～5d，再接入發酵罐，因是好氧性菌（菌體增殖期間），所以要通氣。

具體流程如下：

斜面10mL試管500～1000mL錐形瓶
（250～500mL麥芽汁）含5～10L麥芽汁的卡氏罐發酵罐

（二）生產車間種子制備階段

種子罐擴大培養，一般在生產現場操作。

實驗室制備的孢子斜面或搖瓶種子移接到種子罐進行擴大培養。種子罐培養一方面使菌種獲得足夠的數量，另一方面種子罐中的培養基更接近發酵罐培養的醪液成分和培養條件，譬如通無菌空氣、攪拌等，使菌體適應發酵環境。種子罐的接種方法一般根據菌種種類而異。孢子懸浮液一般用微孔接種法接種，搖瓶懸浮液種子可在火焰保護下接入種子罐，也可以用差壓法接入。種子罐之間或種子罐與發酵罐之間的移種，主要用差壓法，通過種子接種管道進行移種，移種過程中要防止接收罐表壓降為零，因為無壓會引起染菌。

1.種子罐的作用

種子罐的作用主要是使孢子發芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利于產物的合成。

2.種子罐級數的確定

種子罐的級數是指制備種子需逐級擴大培養的次數，這要根據菌種生長的特性、孢子發芽速度和菌體繁殖速度，以及發酵罐的容積而定。為保證種子細胞變異少、衰老細胞所占比例較小，制備種子逐級擴大培養的次數是有嚴格限定的。對于生長快的細胞，種子用量的比例小，即需要的接種量少，所以相應的種子罐也少。如谷氨酸生產中，茄子瓶斜面或搖瓶種子接入種子罐于32℃培養7～10h，菌體濃度達到10⁸～10⁹個/mL，即可作為種子接入發酵罐，這稱為一級種子罐擴大培養，也可叫作二級發酵。生長較慢的菌種，如青霉素生產菌，其孢子懸浮液接入一級種子罐于27℃培養40h，此時孢子發芽，長出短菌絲，再移至含有新鮮培養基的二級種子罐于27℃培養10～24h，菌絲迅速繁殖，獲得粗壯菌體，此菌絲可移至發酵罐作為種子，這稱為二級種子罐擴大培養，也可稱為三級發酵。一般50m³發酵罐都采取三級發酵。如果是實驗室的中試（5～30L），可以直接將孢子或菌體接入罐中發酵，即一級發酵。

為了更有效地實現發酵菌體質和量的積累，種子罐級數越少，越有利于簡化工藝，便于控制，而且可以減少多次移種可能發生的染菌機會。當然，也要考慮盡可能地延長菌體在發酵罐中生產產物的時間，縮短種子增殖的非生產時間，提高發酵罐的生產率［產物/（mL·h）］。此外，種子罐的級數也可通過改善工藝條件，改變種子培養條件，加速菌體的增殖而改變。

3.確定種子罐級數需要注意的問題

（1）種子罐的級數愈少，愈有利于簡化工藝，便于控制。

（2）種子罐級數太少，接種量少，發酵時間延長，降低發酵罐的生產率，增加染菌機會。

（3）種子罐的級數由產物的品種及生產規模而定，也隨著工藝條件的改變做適當的調整。例如，改變種子罐的培養條件、加速孢子的發育或改進孢子瓶的培養工藝后可大大增加孢子數量等，在此基礎上均有可能使三級發酵簡化為二級發酵 。

三、影響種子質量的主要因素

菌種擴大培養的關鍵就是搞好種子罐的擴大培養，影響種子罐培養的主要因素包括營養條件、培養條件、染菌的控制、種子罐的級數和接種量控制等。種子罐培養除了根據菌種特性或生產條件恰當選擇外，還應為菌種的生長創造一個最合理的培養條件。

1.培養基

培養基是微生物獲得生存的營養來源，對微生物生長繁殖、酶的活性與產量都有直接的影響。不同微生物對營養的要求不一樣，但它們所需的基本營養大體上是一致的，其中以碳源、氮源、無機鹽、生長素和金屬離子等最重要。不同類型的微生物所需要的培養基成分與濃度配比并不完全相同，必須按照實際情況加以選擇。提高產量是選擇培養基的一個重要標準，但同時還應當要求培養基組成簡單、來源豐富、價格便宜、取材方便等。一般來說，種子罐是培養菌體的，培養基的糖分要少，而對微生物生長起主導作用的氮源要多，且其中無機氮源所占的比例要大些。種子罐和發酵罐的培養基成分相同，使處于對數生長期的菌種移植在適宜的環境中發酵，可以大大縮短其生長延滯期。其原因是執行代謝活動的酶系已經形成，可立即實施代謝功能，不需花費時間另建適宜新環境的酶系。因此，種子罐和發酵罐的培養基成分趨于一致較好，但各成分的數量（即原料配比）需根據不同的培養目的各自確定。任何生產所用培養基都沒有一個可完全確定的配比，對于某一菌種和具體設備條件來說，最適宜的配比應進行多因素的優選，通過對比試驗來確定。如果菌種的特性或設備條件（如罐型、攪拌的形式和轉速等）變化較大，則培養基的配比應通過試驗相應地變更。只有培養基各成分的關系選得比較恰當，才能最大限度地發揮菌種的特性，提高產量。

2.接種齡和接種量

接種齡和接種量是種子制備過程中重要的控制指標。

接種齡是指種子罐中培養的菌體從開始移入下一級種子罐或發酵罐時的培養時間。在種子罐中，隨著培養時間的延長，菌體量增加，基質消耗和代謝產物積累，菌體量不再增加，逐漸老化。因此，選擇適當的接種齡是一個至關重要的因素。接種齡一般以菌體處于生長旺盛期，且培養液中菌體量還未達到最高峰時，即對數生長期最合適。如果種子過于年幼，接入發酵罐后，會出現前期生長緩慢，整個發酵周期拉長，產物開始形成的時間推遲，而過老的種子也會出現生產能力下降而使菌體自溶的現象。對于不同菌種、不同產品品種、不同工藝條件，其接種齡也不相同，具體的生產，接種齡要進行多次試驗，從發酵產品產量的多少，即產率大小來確定最適接種齡。

接種量指的是移入的種子懸浮液體積和接種后培養液體積的比例?？股氐墓I生產，大多數發酵的最適接種量為7%～15%或更多。啤酒生產發酵的接種量為5%～10%，谷氨酸發酵接種量僅為1%。接種量大小取決于生產菌的生長繁殖速度。大接種量可以縮短發酵罐中菌體數達到高峰的時間，可以提早形成產物。這是因為種子液中含有胞外水解酶類，種子量大，酶量也多，有利于對基質的作用和利用，同時菌體量多，占有絕對生長優勢，可以相對減少雜菌污染的機會。但接種量太大，也會造成菌體生長過速，溶解氧跟不上，從而影響產物的合成。

3.溫度

溫度對微生物的影響，不僅表現在對菌體表面的作用，而且因熱平衡的關系，熱傳遞至菌體內，對菌體內部所有的物質都有作用。由于生物體的生命活動可以看作是相互連續進行的酶反應，任何化學反應又都和溫度有關，通常在生物學范圍內每升高10℃，生長速度就加快1倍，所以溫度直接影響酶反應，進而影響著生物體的生命活動。對于微生物來說，溫度直接影響其生長和合成酶活性。任何微生物的生長都需要有適宜的生長溫度，在此溫度范圍內，微生物生長、繁殖最快。大多數微生物的最適生長溫度在25～37℃范圍內，細菌的最適生長溫度大多比霉菌高些。如果所培養的微生物能承受稍高一些的溫度進行生長、繁殖，可減少污染雜菌的機會，減少夏季培養所需降溫的輔助設備，對工業生產有很大的好處。

溫度和微生物生長的關系：一方面在其最適溫度范圍內，生長速度隨溫度升高而加快；另一方面，不同生長階段的微生物對溫度的反應不同。處于緩慢期的細菌對于溫度的影響十分敏感，將其置于最適生長溫度附近，可以縮短其生長的緩慢期；將其置于較低的溫度，則會延長其緩慢期。孢子萌發的時間在一定溫度范圍內也隨溫度的上升而縮短。處于對數生長期的細菌，如果在略低于最適溫度的條件下培養，即使在發酵過程中升溫，其升溫的破壞作用也顯得較弱，因而在最適生長溫度范圍內，組成菌體的蛋白質很少變性，所以在最適溫度范圍內適當提高對數生長期的培養溫度，既有利于菌體的生長，又能避免熱作用的破壞。處于生長后期的細菌，一般來說其生長速度主要取決于溶解氧而不是溫度，因此在培養后期可適當提高通氣量。此外，不管微生物處于哪個生長階段，每種微生物都有自己的最高生長溫度和最低生長溫度。為了使種子罐培養溫度控制在一定的范圍，生產上常在種子罐上安裝熱交換設備，如夾套、排管或蛇管等進行溫度調節，冬季進風時還需加熱。

4.pH值

培養基的氫離子濃度對微生物的生命活動有顯著影響。各種微生物都有自己生長與合成酶的最適pH值。同一菌種合成酶的類型與酶系組成可隨pH值的改變而產生不同程度的變化。例如，黑曲霉合成柚苷酶時，培養基在pH 6.0以上的環境中，果膠酶活性受到抑制，pH值改變到6.0以下就形成果膠酶，且酶系組成由pH值決定。泡盛酒曲霉突變株在pH 6.0條件下培養時以產生α-淀粉酶為主，糖化型淀粉酶與麥芽糖酶產生極少，在pH 2.4條件下培養，轉向糖化型淀粉酶與麥芽糖酶的合成，α-淀粉酶受到抑制。

由此可見，培養基的pH值與微生物生命活動和酶系組成關系十分密切。培養基pH值在發酵過程中能被菌體代謝所改變，陰離子（如醋酸根、磷酸根）被吸收或氮源被利用后NH₃的產生，使pH值上升；陽離子（如、K⁺）被吸收或有機酸的積累，使pH值下降。一般來說，高碳源培養基傾向于向酸性pH值轉移，高氮源培養基傾向于向堿性pH值轉移，這都跟碳氮比直接相關。因此，培養基必須保持適當的pH值，而調節pH值的方法有三種，即使用酸堿溶液、緩沖液以及各種生理緩沖劑（如生理酸性與生理堿性的鹽類）。

5.通氣與攪拌

好氧菌或兼性需氧菌的生長與合成酶都需要供給氧氣。不同微生物要求的通氣量不同，即使是同一菌種，在不同生理時期對通氣量的要求也不相同。因此，在控制通氣條件時，必須考慮到既能滿足菌種生長與合成酶的不同要求，又要節省電耗，以提高經濟效益。通氣可以供給大量的氧，而攪拌則能使通氣的效果更好，并且攪拌有利于熱交換，使培養液的溫度較一致，有利于營養物質和代謝物質的分散。此外，選用擋板可使攪拌效果更好。通氣量與菌種、培養基的性質以及培養階段有關。在培養階段的各個時期究竟如何選擇通氣量，要根據菌種的特性、罐的結構、培養基的性質等許多因素，通過試驗確定。通氣量的多少，最好按氧溶解的多少決定。只有氧溶解的速度大于菌體的吸氧速度時，菌體才能正常地生長和合成酶，否則氧的溶解比消耗少，氧的濃度降低，降到某一濃度（稱溶解氧的臨界點）時，菌體生長就減慢。因此，隨著菌體繁殖、呼吸增強，必須按菌體的吸氧量加大通氣量，以增加溶解氧的量。一般來說，培養罐深、攪拌轉速大、通氣管開孔面積小或數量多，氣泡在培養液內停留時間就長，氧的溶解速度也就大，且在這些因素確定的條件下，培養基的黏度越小，氧的溶解速度也越大。因此，根據罐的結構考慮培養液的黏度，增加一定的通氣量，可以達到菌體所需的溶解氧，滿足菌體呼吸的需要。

攪拌可以提高通氣效果，促進微生物的繁殖，但是劇烈攪拌會導致培養液大量涌泡，液膜表層的酶容易氧化變性，損傷微生物細胞，同時泡沫過多將增加雜菌污染的機會。

6.泡沫

菌種培養過程中產生的泡沫與微生物的生長和合成酶有關。泡沫的持久存在影響微生物對氧的吸收，妨礙二氧化碳的排除，因而破壞其生理代謝的正常進行，不利于發酵。此外，由于泡沫大量地產生，致使培養液的容量一般只是種子罐容量的一半左右，大大影響設備的利用率，甚至發生跑料現象，導致染菌，使損失更大。

在菌種培養過程中產生泡沫的原因是很多的。通氣、機械攪拌使液體分散和空氣竄入形成氣泡，培養基中某些成分的變化或微生物的代謝活動產生氣泡，培養基中某些成分（如蛋白質及其他膠體物質）的分子在氣泡表面排列形成堅固的薄膜，不易破裂，聚成泡沫層。

對菌種培養過程的消泡措施的研究，主要偏重于化學消泡和機械消泡，并取得了一定的進展。微生物工業目前使用的消泡劑，有各種天然的動植物油以及來自石油化工生產的礦物油、改性油、表面活性劑等，這類消泡劑往往因培養液的pH值、溫度、成分、離子濃度以及表面性質的改變，在消泡能力上呈現很大的差別，在培養液內殘留量也高，給凈化處理造成不同程度的困難。而新型的有機硅聚合物如硅油、聚硅氧烷樹脂等，則具有效率高、用量省、無毒性、無代謝性，同時兼有提高微生物合成酶活性等多種優良特性，是一類有發展前途的消泡劑。泡沫的控制除了添加消泡劑外，改進培養基成分也是相輔相成的一個重要方面。例如，在培養基配料中增加磷酸鹽已在某些場合收到實效，可使消泡劑添加量大幅降低。

7.染菌的控制

染菌是微生物發酵生產的大敵，一旦發現染菌，應及時進行處理，以免造成更大的損失。如果不是設備本身結構存在“死角”，染菌的原因歸納起來主要包括設備、管道、閥門漏損，滅菌不徹底，空氣凈化不好，無菌操作不嚴或菌種不純等。因此，要控制染菌繼續發展，必須及時找出染菌的原因，采取措施，杜絕染菌事故再現。菌種發生染菌會使各個發酵罐都染菌。因此，必須加強接種室的消毒管理工作，定期檢查消毒效果，嚴格無菌操作技術。如果新菌種不純，則需反復分離，直至完全純粹為止。對于已出現雜菌菌落或噬菌體噬斑的試管斜面菌種，應予以廢棄。在平時應經常分離試管菌種，以防菌種衰退、變異和污染雜菌。對于菌種擴大培養的工藝條件要嚴格控制，對種子質量更要嚴格掌握，必要時可將種子罐冷卻，取樣做純菌試驗，確認種子無雜菌存在，才能向發酵培養基中接種。

四、種子質量的控制措施

種子質量的優劣是通過它在發酵罐中所表示的生產率來體現的。因此必須保證生產菌種的穩定性，在種子培養期間保證提供適宜的環境條件，保證無雜菌侵入，從而獲得優良的種子。因此，在生產過程中通常進行以下兩項檢查。

1.菌種穩定性的檢查

生產中所用的菌種必須保持穩定的生產能力，不能有變異種。盡管變異的可能性很小，但不能完全排除這一危險。所以，定期檢查和挑選穩定菌株是必不可少的一項工作。方法是：將保藏菌株溶于無菌的生理鹽水中，逐級稀釋，然后在培養皿瓊脂固體培養基上劃線培養，長出菌落，選擇形態優良的菌落接入錐形瓶進行液體搖瓶培養，檢測出生產率高的菌種備用。這一分離方法適用于所有的保藏菌種，并且一年左右必須做一次。

2.雜菌檢查

在種子制備過程中，每移種一次都需要進行雜菌檢查。一般的方法是：顯微鏡觀察或平板培養試驗（即將種子液涂在平板培養皿上劃線培養，觀察有無異常菌落，定時檢查，防止漏檢）。此外，也可對種子液的生化特性進行分析，如取樣測其營養消耗速度，pH變化，溶解氧利用情況，色澤、氣味是否異常等。

由于菌種在種子罐中的培養時間較短，使種子的質量不容易控制，因此可分析的參數不多。一般在培養過程中要定期取樣，測定其中的部分參數來觀察基質的代謝變化以及菌體形態是否正常。例如酒精酵母的種子罐，一般定時測酸度變化、還原糖含量、耗糖率且進行鏡檢等，鏡檢內容包括測酵母細胞數、酵母出芽率、酵母形態（整齊、大小均勻、橢圓形或圓形）、是否有雜菌等。酶活力來判斷種子的質量是一種新的判斷，如土霉素發酵中，種子液的淀粉酶活力與發酵單位有一定關系，種子液淀粉能力強（淀粉酶活力高），則接入發酵罐后土霉素發酵單位也高，反之則低。因此，在選用種子時，用測定種子液中淀粉酶的活力來判斷種子質量的方法是可行的。

五、種子質量標準

發酵工業上常見的微生物有細菌、酵母菌、霉菌和放線菌等類群。種子質量的最終指標是考察其在發酵罐中所表現出來的生產能力，種子質量的評價通常從細胞或菌體的形態、生化指標、產物生成量、酶活力這幾個方面進行。

1.細胞或菌體形態

主要考察菌絲形態、菌絲濃度和培養液外觀（色素、顆粒等）。對于細菌、酵母菌等單細胞生物來說，要求菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態；對于霉菌、放線菌，要求菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分支情況和內含物情況好。

2.生化指標

生化指標包括種子液的糖、氮、磷的含量和pH值變化。

3.產物生成量

在抗生素發酵中，產物生成量是考察種子質量的重要指標，因為種子液中產物生成量的多少間接反映種子的生產能力和成熟程度。

4.酶活力

種子液中某種酶的活力，與目的產物的產量有一定的關聯。