任務(wù)七　大米中黃曲霉素B₁的測(cè)定

（一）原理

樣品中黃曲霉毒素B₁經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，在波長(zhǎng)365 nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來(lái)測(cè)定含量。薄層板上黃曲霉毒素B₁的最低檢出量為0.0004 μg，最低檢出濃度為5 μg/kg。

（二）試劑

① 三氯甲烷。

② 正己烷或石油醚（沸程30～60℃或60～90℃）。

③ 甲醇。

④ 苯。

⑤ 乙腈。

⑥ 無(wú)水乙醚或乙醚經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水。

⑦ 丙酮。

以上試劑①～⑦在試驗(yàn)時(shí)先進(jìn)行一次試劑空白試驗(yàn)，如不干擾測(cè)定即可使用，否則需逐一進(jìn)行重蒸。

⑧ 硅膠G：薄層色譜用。

⑨ 三氟乙酸。

⑩ 無(wú)水硫酸鈉。

氯化鈉。

苯-乙腈混合液：量取98 mL苯，加2 mL乙腈，混勻。

甲醇水溶液：55∶45。

黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)溶液制備方法如下。

a.儀器校正。測(cè)定重鉻酸鉀溶液的摩爾消光系數(shù)，以求出使用儀器的校正因素。準(zhǔn)確稱取25 mg經(jīng)干燥的重鉻酸鉀（基準(zhǔn)級(jí)），用硫酸（0.5+ 1000）溶解后并準(zhǔn)確稀釋至200 mL，相當(dāng)于 c（K₂Cr₂O₇ ）=0.0004 mol/L。再吸取25 mL此稀釋液于50 mL容量瓶中，加硫酸（0.5+1000）稀釋至刻度，相當(dāng)于0.0002 mol/L溶液。再吸取25 mL此稀釋液于50 mL容量瓶中，加硫酸 （0.5+1000）稀釋至刻度，相當(dāng)于0.0001 mol/L溶液。用1 cm石英杯，在最大吸收峰的波長(zhǎng) （接近350 nm處）用硫酸（0.5+1000）作空白，測(cè)得以上3種不同濃度溶液的吸光度，并按式（1）計(jì)算出以上3種濃度溶液的摩爾消光系數(shù)的平均值：

（1）

式中　E——重鉻酸鉀溶液的摩爾消光系數(shù)；

　 　A₁——測(cè)得重鉻酸鉀溶液的吸光度；

　　　c——重鉻酸鉀溶液的物質(zhì)的量濃度。

再以此平均值與重鉻酸鉀的摩爾消光系數(shù)值3160比較，即求出使用儀器的校正因素[式（2）]：

（2）

式中　f——使用儀器的校正因素；

　　　E——測(cè)得的重鉻酸鉀摩爾消光系數(shù)平均值。

若f>0.95或f<1.05，則使用儀器的校正因素可略而不計(jì)。

b.黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備　準(zhǔn)確稱取1～1.2 mg黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)品，先加入2 mL乙腈溶解后，再用苯稀釋至100 mL，避光，置于4℃冰箱保存。該標(biāo)準(zhǔn)溶液約為10 μg/mL。用紫外分光光度計(jì)測(cè)此標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收峰波長(zhǎng)及該波長(zhǎng)的吸光度值[式（3）]。

（3）

式中　X₁——黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，μg/mL；

　 　　A——測(cè)得的吸光度值；

　　 　f——使用儀器的校正因素；

　 　　M——黃曲霉毒素B₁的摩爾質(zhì)量，為312 g/mol；

　　　E——黃曲霉毒素B₁在苯-乙腈混合液中的摩爾消光系數(shù)，為19800 L/ （mol·cm）。

根據(jù)計(jì)算，用苯-乙腈混合液調(diào)到標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度10.0μg/mL，并用分光光度計(jì)核對(duì)其濃度。

c.純度的測(cè)定。取10 μg/mL黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)溶液5 μL ，滴加于涂層厚度0.25 mm的硅膠 G薄層板上，用甲醇-三氯甲烷（4+96）與丙酮-三氯甲烷（8+92）展開劑展開，在紫外燈下觀察熒光的產(chǎn)生，必須符合以下條件：

在展開后，只有單一的熒光點(diǎn)，無(wú)其他雜質(zhì)熒光點(diǎn)；

原點(diǎn)上沒有任何殘留的熒光物質(zhì)。

黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液。準(zhǔn)確吸取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/mL）于10 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液至刻度，混勻。此溶液每毫升相當(dāng)于10 μg黃曲霉毒素B₁ 。吸取1.0 mL此稀釋液，置于5 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀釋至刻度，此溶液每毫升相當(dāng)于0.2 μg黃曲霉毒素B₁ 。再吸取黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 μg/mL）1.0 mL置于5 mL容量瓶中，加苯-乙腈混合液稀釋至刻度，此溶液每毫升相當(dāng)于0.04 μg黃曲霉毒素B₁ 。

次氯酸鈉溶液（消毒用）。取100 g漂白粉，加入500 mL水，攪拌均勻。另將80 g工業(yè)用碳酸鈉（Na₂CO₃·10H₂O）溶于500 mL溫水中，再將兩液混合、攪拌，澄清后過(guò)濾。此濾液含次氯酸濃度約為25 g/L。若用漂粉精制備，則碳酸鈉的量可以加倍。所得溶液的濃度約為 50 g/L。污染的玻璃儀器用10 g/L次氯酸鈉溶液浸泡半天或用50 g/L次氯酸鈉溶液浸泡片刻后，即可達(dá)到去毒效果。

重鉻酸鉀。

硫酸（0.5+1000）。

碳酸鈉。

漂白粉。

（三）儀器

① 小型粉碎機(jī)。

② 樣篩。

③ 電動(dòng)振蕩器。

④ 全玻璃濃縮器。

⑤ 玻璃板： 5 cm×20 cm。

⑥ 薄層板涂布器。

⑦ 展開槽：內(nèi)長(zhǎng)25 cm、寬6 cm、高4 cm。

⑧ 紫外燈： 100～125 W，帶有波長(zhǎng)365 nm的濾光片。

⑨ 微量注射器或血色素吸管。

⑩ 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

吹風(fēng)機(jī)。

（四）分析步驟

1.取樣

樣品中若混有污染黃曲霉毒素含量高的霉粒，一粒就可以左右測(cè)定結(jié)果，而且有毒霉粒的比例小，分布不均勻，為避免取樣帶來(lái)的誤差，必須大量取樣，并將該大量樣品粉碎，混合均勻，才有可能得到確能代表一批樣品的相對(duì)可靠的結(jié)果。因此，采樣應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。

① 根據(jù)規(guī)定采取有代表性樣品。

② 對(duì)局部發(fā)霉變質(zhì)的樣品檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)單獨(dú)取樣。

③ 小麥粉樣品全部通過(guò)20目篩，混勻。必要時(shí)，每批樣品可采取3份大樣作樣品制備及分析測(cè)定用，以觀察所采樣品是否具有一定的代表性。

2.提取

稱取20.00 g過(guò)篩樣品，置于250 mL具塞錐形瓶中，加30 mL正己烷或石油醚和100 mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂一層水，蓋嚴(yán)防漏。振蕩30 min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過(guò)濾于分液漏斗中，待下層甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶?jī)?nèi)。取 20.00 mL甲醇水溶液（相當(dāng)于4 g樣品）置于另一125 mL分液漏斗中，加20 mL三氯甲烷，振搖2 min，靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層。放出三氯甲烷層，經(jīng)盛有約10 g預(yù)先用三氯甲烷濕潤(rùn)的無(wú)水硫酸鈉的定量慢速濾紙過(guò)濾于50 mL蒸發(fā)皿中，再加5 mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量三氯甲烷洗過(guò)濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放在通風(fēng)柜中于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后放在冰盒上冷卻2～3 min后，準(zhǔn)確加入1 mL苯-乙腈混合液（或?qū)⑷燃淄橛脻饪s蒸餾器減壓吹氣蒸干后，準(zhǔn)確加入1 mL苯-乙腈混合液）。用帶橡皮頭的滴管的管尖將殘?jiān)浞只旌希粲斜降慕Y(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2 mL具塞試管中。

3.測(cè)定

（1）單向展開法

①薄層板的制備。稱取約3 g硅膠G，加相當(dāng)于硅膠量2～3倍左右的水，用力研磨1～2 min 至成糊狀后立即倒于涂布器內(nèi)，推成5 cm×20 cm、厚度約0.25 m的薄層板三塊。在空氣中干燥 約15 min后，在100℃活化2 h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3 d，若放置時(shí)間較長(zhǎng)，可再活化后使用。

②點(diǎn)樣。將薄層板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3 cm的基線上用微量注射器或血色素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距約為1 cm，點(diǎn)直徑約3 mm。在同一板上滴加點(diǎn)的大小應(yīng)一致，滴加時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)用冷風(fēng)邊吹邊加。滴加樣式如下。

第一點(diǎn)：10 μL黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04 μg/mL）。

第二點(diǎn)：20 μL樣液。

第三點(diǎn)：20 μL樣液+10 μL 黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04 μg/mL）。

第四點(diǎn)： 20μL樣液+10 μL 黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.2 μg/mL）。

③ 展開與觀察。在展開槽內(nèi)加10 mL無(wú)水乙醚，預(yù)展12 cm，取出揮干。再于另一展開槽內(nèi)加10 mL丙酮-三氯甲烷（8+92），展開10～12 cm，取出。在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下。

a.由于樣液點(diǎn)上加滴黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液，可使黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液中的黃曲霉毒素B₁熒光點(diǎn)重疊。如樣液為陰性，薄層板上的第三點(diǎn)中黃曲霉毒素B₁為0.0004 μg，可用作檢查在樣液內(nèi)黃曲霉毒素B₁最低檢出量是否正常出現(xiàn)；如為陽(yáng)性，則起定性作用。薄層板上的第四點(diǎn)中黃曲霉毒素B₁為0.002 μg，主要起定位作用。

b.若第二點(diǎn)在與黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)位置上無(wú)藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，表示樣品中黃曲霉毒素B₁含量在5 μg/kg以下；如在相應(yīng)位置上有藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，則需進(jìn)行確證試驗(yàn)。

④ 確證試驗(yàn)。為了證實(shí)薄層板上樣液熒光系由黃曲霉毒素B₁產(chǎn)生的，加滴三氟乙酸，產(chǎn)生黃曲霉毒素B₁的衍生物，展開后此衍生物的比移值約在0.1。于薄層板左邊依次滴加兩個(gè)點(diǎn)。

第一點(diǎn)： 10 μL黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04 μg/mL）。

第二點(diǎn)： 20 μL樣液。

于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5 min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2 min后，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40℃。

再于薄層板上滴加以下兩個(gè)點(diǎn)。

第三點(diǎn)： 10 μL 黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04 μg/mL）。

第四點(diǎn)： 20 μL樣液。

再展開（同③），在紫外燈下觀察樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物。未加三氟乙酸的三、四兩點(diǎn)，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對(duì)照。

⑤ 稀釋定量。樣液中的黃曲霉毒素B₁熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度如與黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最低檢出量（0.004 μg）的熒光強(qiáng)度一致，則樣品中黃曲霉毒素B₁含量即為5μg/kg。如樣液中熒光強(qiáng)度比最低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)減少滴加量或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌浚敝翗右狐c(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。滴加式樣如下。

第一點(diǎn)： 10 μL黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04 μg/mL）。

第二點(diǎn)：根據(jù)情況滴加10 μL樣液。

第三點(diǎn)：根據(jù)情況滴加15 μL樣液。

第四點(diǎn)：根據(jù)情況滴加20 μL樣液。

⑥ 計(jì)算：樣品中黃曲霉毒素B₁的含量按式（4）計(jì)算。

（4）

式中　X₂——樣品中黃曲霉毒素B₁的含量，μg/kg；

　　　V₁——加入苯-乙腈混合液的體積，mL；

　　　V₂——出現(xiàn)最低熒光時(shí)而加樣液的體積，mL；

　　　D ——樣液的總稀釋倍數(shù)；

　 　　m——加入苯-乙腈混合液溶解時(shí)相當(dāng)樣品的含量，g；

　0.0004——黃曲霉毒素B₁的最低檢出量，μg。

結(jié)果表述：報(bào)告測(cè)定值的整數(shù)位。

（2）雙向展開法　如用單向展開法展開后，薄層色譜由于雜質(zhì)干擾掩蓋了黃曲霉毒素B₁的熒光強(qiáng)度，需采用雙向展開法。薄層板先用無(wú)水乙醚作橫向展開，將干擾的雜質(zhì)展至樣液點(diǎn)的一邊而黃曲霉毒素B₁不動(dòng)，然后再用丙酮、三氯甲烷（8+92）作縱向展開，樣品在黃曲霉毒素B₁相應(yīng)處的雜質(zhì)底色大量減少，因而提高了方法靈敏度。如用雙向展開中滴加兩點(diǎn)法展開仍有雜質(zhì)干擾時(shí)，則可改用滴加一點(diǎn)法。

①滴加兩點(diǎn)法

a.點(diǎn)樣。取薄層板3塊，在距下端3 cm基線上滴加黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在3塊板的距左邊緣0.8～1 cm處各滴加10 μL黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04 μg/mL），在距左邊緣2.8～3 cm處各滴加20 μL樣液，然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上加滴10 μL 0.04 μg/mL黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液，在第三塊板的樣液點(diǎn)上加滴10 μL 黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.2 μg/mL）。

b.展開。

橫向展開。在展開槽內(nèi)的長(zhǎng)邊置一玻璃支架，加10 mL無(wú)水乙醇，將上述點(diǎn)好的薄層板 靠標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的長(zhǎng)邊置于展開槽內(nèi)展開，展至板端后，取出揮干，或根據(jù)情況需要時(shí)可再重復(fù)展開 1～2次。

縱向展開。揮干的薄層板以丙酮-三氯甲烷（8+92）展開至10～12 cm為止。丙酮-三氯甲烷的比例根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)。

c.觀察及評(píng)定結(jié)果。在紫外燈下觀察第一、二板，若第二板的第二點(diǎn)在黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而第一板在與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則樣品中黃曲霉毒素B₁含量在 5 μg/kg以下。

若第一板在與第二板的相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一板與第三板比較，看第三板上 第二點(diǎn)與第一板上第二點(diǎn)的相同位置上的熒光點(diǎn)是否與黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行確證試驗(yàn)。在具體測(cè)定中，第一、二、三板可以同時(shí)做，也可按照順序做。如按順序做，當(dāng)在第一板出現(xiàn)陰性時(shí)，第三板可以省略，如第一板為陽(yáng)性，則第二板可以省略，直接做第三板。

d.確證試驗(yàn)。另取薄層板兩塊，于第四、五兩板距左邊緣0.8～1 cm處各滴加10 μL黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04 μg/mL）及1小滴三氟乙酸；在距左邊緣2.8～3 cm處，于第四板滴加 20 μL樣液及1小滴三氟乙酸；于第五板滴加20 μL樣液、10μL黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液 （0.04 μg/mL）及1小滴三氟乙酸。反應(yīng)5 min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2 min，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40℃，再用雙向展開法展開后，觀察樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物。 觀察時(shí)，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。如樣液黃曲霉毒素B₁含量高時(shí)，則將樣液稀釋后，按（1）④做確證試驗(yàn)。

e.稀釋定量。如樣液黃曲霉毒素B₁含量高時(shí)，按（1）⑤稀釋定量操作。如黃曲霉毒素B₁含量低，稀釋倍數(shù)小，在定量的縱向展開板上仍有雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果的判斷，可將樣液再做雙向展開法測(cè)定，以確定含量。

f.結(jié)果計(jì)算。同（1）⑥。

②滴加一點(diǎn)法。

a.點(diǎn)樣。取薄層板3塊，在距下端3 cm基線上滴加黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在3塊板距左邊緣0.8～1 cm處各滴加20 μL樣液，在第二板的點(diǎn)上加滴10 μL黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04 μg/mL），在第三板的點(diǎn)上加滴10 μL黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2 μg/mL）。

b.展開。同①b的橫向展開與縱向展開。

c.觀察及評(píng)定結(jié)果。在紫外燈下觀察第一、二板，如第二板出現(xiàn)最低檢出量的黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，而第一板與其相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則樣品中黃曲霉毒素B₁含量在5 μg/kg以下。如第一板在與第二板黃曲霉毒素B₁相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一板與第三板比較，看第三板上與第一板相同位置的熒光點(diǎn)是否與黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行以下確證試驗(yàn)。

d.確證試驗(yàn)。另取兩板，于距左邊緣0.8～1 cm處，第四板滴加20 μL樣液、1滴三氟乙酸；第五板滴加20 μL樣液、10 μL 黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04 μg/mL）及1滴三氟乙酸，產(chǎn)生衍生物及展開方法同①d。再將以上二板在紫外燈下觀察，以確定樣液點(diǎn)是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B₁標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物，觀察時(shí)可將第一板作為樣液的衍生物空白板。經(jīng)過(guò)以上確證試驗(yàn)確定為陽(yáng)性后，再進(jìn)行稀釋定量，如黃曲霉毒素B₁含量低，不需稀釋或稀釋倍數(shù)小，雜質(zhì)熒光仍有嚴(yán)重干擾，可根據(jù)樣液中黃曲霉毒素B₁熒光的強(qiáng)弱，直接用雙向展開法定量。

e.結(jié)果計(jì)算。同（1）⑥。