1.6　細菌的生長

1.6.1　細菌的生長曲線

細菌細胞個體生長的過程是極其復雜的生化過程，實際上是細胞為下一次分裂積極準備的過程。當生長完成時細胞就開始分裂了，一個細胞分裂成為兩個細胞，新生長的細胞就開始了下一個生長周期。由于細菌個體微小，對于研究細菌個體生長和繁殖困難較大，往往研究群體的數量的變化。對于細菌群體生長規律的研究是通過分析細菌培養物的生長曲線進行的。通常將細菌置于一個封閉系統中，在液體培養基中進行分批培養。如果以培養時間為橫坐標，以菌量的對數值或生長速度為縱坐標作圖，就可以作出一條曲線，稱為生長曲線，見圖1.6。測定細菌的生長曲線對于掌握細菌生長規律很重要。生長曲線反映出了細菌單細胞在單次培養條件下從生長繁殖開始到衰老死亡全過程的動態變化規律。通過生長曲線可以知道細菌在哪個時期生長代謝活躍，哪個時期衰老而瀕于死亡。這樣可根據不同的需要，選擇不同時期的菌種。細菌的生長曲線可以劃分為四個階段：延滯期、對數期、恒定期和衰亡期。

1.6.1.1　延滯期

延滯期又稱調整期、停遲期或延緩期。當細菌被接種到新鮮的培養基時，細胞的數量通常不立即增加，在這一時期內生長速度近乎于零，細菌數幾乎不變，這一階段稱為延滯期。在延滯期盡管細胞沒有立即分裂而導致數量的凈增加，但細胞代謝活躍，一直在合成新的細胞成分，表現為胞內RNA含量增高，原生質嗜堿性加強，對氧的吸收、CO2釋放以及脫氨作用也很強，容易產生各種誘導酶，此時的細胞對外界不利因素的影響較敏感。延滯期出現的原因有以下幾個方面：

①細胞老化，細胞體內缺乏ATP、必要的輔助因子及核糖體；

②新的培養基與原來的培養基成分不同，細胞需要一定的時間來合成新的酶；

③細菌細胞受損，需要一定時間恢復。

另外，延滯期的長短還受到菌種的遺傳特性、菌齡等因素的影響。延滯期短的只有幾分鐘，長的達幾個小時，甚至數十小時。延滯期太長不利于工業生產，因此應盡量縮短延滯期。常用的措施有增加接種量、采用最適菌齡（即處于對數期的種子）或在培養基中加入某些成分，從而縮短細菌的延滯期。

1.6.1.2　對數期

對數期又稱指數期，此生長期最顯著的特點是細菌細胞數目以穩定的速率按幾何級數增加。在此階段，細胞代謝活躍，細菌以最快的速度進行生長和分裂，生長速度不變，細胞繁殖一代所需時間保持恒定，生長曲線是平滑的。在對數期，細菌的生長是均衡生長，即所有細胞組分彼此以相對穩定速度合成。

1.6.1.3　恒定期

恒定期又稱穩定期或最高生長期，經過對數生長期，群體的生長最終會停止，活細胞總數處于動態平衡，即新增殖的細胞與死去的老細胞數幾乎相等，生長曲線趨于平穩，因此外表看上去這時的生長速度趨于零。恒定期的細菌在數量上達到了最高峰，細菌細胞濃度通常在109個/mL左右。恒定期細菌細胞總數量保持恒定，可能是分裂產生的新細胞與死亡細胞數量相等，或者是細胞停止分裂而保持代謝活性。恒定期細菌細胞濃度受到營養條件、細菌種類及其他因素的影響。在分批培養過程中，細菌細胞不能按對數期的高速度無限地生長，細菌生長進入恒定期可能是由多種因素共同決定的。細菌進入恒定期的原因有以下幾個方面：

①營養物有限，如果一種必需的營養物質嚴重缺乏，細菌的生長速度就會減慢；

②溶液中有害產物累積；

③溶液pH值、氧化還原電位等物化條件不適宜；

④好氧菌受氧濃度的限制，溶液中可溶性O2的含量消耗或降低，使得細菌細胞可能由于缺氧而不能生長，對于厭氧細菌來說，細菌可以發酵糖類產生大量的乳酸和其他有機酸，致使培養基呈酸性，從而抑制細菌生長。

1.6.1.4　衰亡期

繼恒定期之后，細胞死亡速度超過繁殖速度，群體中活菌總數逐漸下降，出現“負生長”。到了最后一段時間，活菌按幾何級數下降，有人稱它為“對數死亡”階段。在衰亡期營養物質的消耗和有害廢物的積累引起環境條件惡化，導致活細胞數量下降，細胞內含顆粒更明顯，液泡出現，有的菌體開始自溶，并釋放出一些產物，如氨基酸、醇或抗生素等。衰亡期里活細胞與死細胞總數保持恒定。

盡管大多數細菌以對數方式死亡，但當細胞數量突然減少后，某些抗性特別強的個體繼續存活，所以衰亡期曲線可能是復雜的。

1.6.2　細菌生長的計算

研究細菌在對數期的生長速度是十分必要的。在對數期細胞數量以2的指數（2n）方式增加，細胞增加一倍所需時間稱為代時或倍增時間。細胞數量以對數方式增加。

Nt=N0×2n

（1.4）

式中,N0為起始細胞數；Nt為t時間細胞數；n為世代數。

式（1.4）經過變化，得到式（1.5）：

lgNt=lgN0+nlg2

（1.5）

（1.6）

如果用k表示分批培養時細菌細胞平均生長速度常數：

（1.7）

細胞總數增加一倍所需時間為平均代時，或平均倍增時間g，此時t=g，而N=2N0，代入式（1.4）得：

（1.8）

因而平均代時是平均生長速度常數的倒數。

（1.9）

例如，某細菌數量在10h內由103個增加到109個時，平均代時g和平均生長速度k為：

（1.10）

=0.5h/代或30min/代

（1.11）

1.6.2.1　測量生長量的方法

（1）細胞體積的測定　將一定體積的菌懸液放在刻度離心管中，離心后觀察沉淀細胞的體積。

（2）稱重法　將一定量的菌液離心或過濾，得到菌體，經洗滌后即可稱其濕重或干重。

（3）比濁法　使用光電比色計測菌液的透光度，或自行制作比濁管進行目測。

（4）含氮量測定　蛋白質是細胞的主要物質，含量一般比較穩定，而氮又是蛋白質的重要組分。細菌的含氮量約為原生質干重的14%，含氮量與蛋白質的關系如下：蛋白質總量=6.25×含氮量（%）。先用克氏定氮法測出細胞含氮量，然后根據公式算出細胞生長量。

（5）DNA含量測定　DNA與20%的3，5-二氨基苯甲酸-鹽酸溶液能顯示特殊的熒光，根據這一原理測出DNA的含量，即可推算出細菌的總量。每個細菌平均含DNA為8.4×10-14g。

（6）生理指標測定法　有些生理指標如耗氧量或CO2等代謝產物的量在一定條件下與群體生長量成正比，故可作測定生長量的指標。

1.6.2.2　測量細胞數的方法

（1）直接計數法　菌液樣品置于血球計數器內，在顯微鏡下直接觀察計數，也可以將待測樣品與已知濃度的菌液或紅細胞等量混合后，固定并染色，然后參照已知濃度的樣品，按比例計數出未知樣品的菌數。

（2）平板菌落計數法　菌液充分稀釋后，取樣涂布在瓊脂平板上培養，最后根據長出的菌落數和稀釋倍數算出樣品中的活菌總數。

（3）液體稀釋法　將單細胞或單孢子的懸浮液按次序逐級稀釋，經過培養后，以臨界生長的稀釋度來推算樣品中活菌總數。

上述幾種方法適用于單細胞單孢子的測定。對于絲狀霉菌可通過測定菌落直徑或面積來衡量它們的生長速度。總之，測定生長的方法很多，實際工作中應根據研究的對象和工作條件加以選擇。