1.7　修復重金屬污染廢水的微生物

1.7.1　修復微生物的種類

微生物修復的概念分為以下兩類[3]。

①廣義的生物修復:指一切以利用生物為主體的環境污染的治理技術。它包括利用植物、動物和微生物吸收、降解、轉化土壤和水體中的污染物，使污染物的濃度降低到可接受的水平，或將有毒有害的污染物轉化為無害的物質，也包括將污染物穩定化，以減少其向周邊環境的擴散。一般分植物修復、動物修復和微生物修復三種類型。根據生物修復污染物的種類，可分為有機污染生物修復和重金屬污染的生物修復和放射性物質的生物修復等。

②狹義的微生物修復:是指通過微生物的作用清除土壤和水體中的污染物，或是使污染物無害化的過程。它包括自然的和人為控制條件下的污染物降解或無害化過程。

重金屬的微生物修復就是通過微生物來對環境中重金屬離子進行吸收、沉淀、固定、共價轉化等方式，把重金屬離子轉化為低毒產物，從而降低環境中重金屬的毒性。目前，研究較多的微生物種類有細菌中的假單胞菌（Pseudo-monansp.）、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）及根瘤菌屬（RhizobiumFrank），包括特殊的趨磁性細菌（Magnetotacticbacteria）和工程菌等;真菌中的釀酒酵母（Saccharomycescerevisia）、假絲酵母（Candida）、黃曲霉（Aspergillusflavus）、黑曲霉（AspergillusNiger）、白腐真菌（Whiterotfungi）、食用菌等和藻類中的綠藻（Greenalgae）、紅藻（Redalgae）、褐藻（Brownalgae）、魚腥藻屬（Anabaenasp.）、顫藻屬（Oscillatoria）、束絲藻（Aphanizomenon）及小球藻（Chlorella）等。按營養類型可將自然界的微生物分為自養型微生物和異樣型微生物，和重金屬修復有關的微生物大部分屬于自養型微生物。這類微生物在生長繁殖中不需要任何有機營養，完全靠周圍土壤而生存，異氧微生物則與之相反，需要提供有機營養物質才能生存。

目前研究比較多，在生產中得到應用的主要是自養微生物，大部分是土著微生物。土著微生物是由固定碳素的光合細菌、抑制病害的放線菌、分解糖類的酵母菌、在嫌氣狀態下有效分解的乳酸菌等幾十種微生物組成的群落。目前在重金屬污染廢水修復工藝中應用的主要修復細菌見表1.11。

1.7.2　修復微生物的培養與馴化

1.7.2.1　微生物的培養基

微生物從中吸取營養并賴以生存繁殖的介質稱培養基，分液體和固體兩種形式。液體培養基用于粗略地分離培養某種微生物，而進行微生物的純種分離則要用固體培養基。修復細菌（自養菌）的液體培養基是由水和溶解在其中的各種無機鹽組成的，每種細菌都有自己特有的培養基配方，這些配方是經研究者的試驗研究之后提出的[4]。幾種常用的修復細菌的培養基介紹如下。

苦味諾卡菌、溝戈登菌和膠質芽孢桿菌所用的培養基配方為：牛肉膏3g、蛋白胨5g、氯化鈉5g、水1000mL，pH7.0～7.2。培養方法為：制備液體培養基時，先用精確到0.001g的電子天平稱取培養基各組成物質，依次將它們放入盛有蒸餾水的錐形瓶中加熱溶解；封裝后放入壓力蒸汽滅菌器中，在120℃的溫度下滅菌30min，冷卻后擺于潔凈無菌操作臺上用紫外燈照射30min，再將保存菌種接種至液體培養基內，放入恒溫空氣浴振蕩箱中，在28℃，160r/min的條件下培養6d后，用高速離心機從含菌液中分離出微生物細胞作吸附劑及檢測用。

枯草芽孢桿菌所用培養基配方為：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、葡萄糖20g、水1000mL，pH7.0。培養方法為：制備液體培養基時，先用精確到0.001g的電子天平稱取培養基各組成物質，依次將它們放入盛有蒸餾水的錐形瓶中加熱溶解；封裝后放入壓力蒸汽滅菌器中，在118℃的溫度下滅菌15min，冷卻后擺于潔凈無菌操作臺上用紫外燈照射20min，再將保存菌種接種至液體培養基內，在恒溫空氣浴振蕩箱中，在30℃、160r/min的條件下培養24h，然后用高速離心機從含菌液中分離出微生物細胞作吸附劑及檢測用。

固體培養基是在上述液體培養基中加入1.5%左右的瓊脂或一定量的硅膠制成的。首先在加熱條件下配成一定濃度的瓊脂溶液，將此溶液消毒后再加入無菌過濾的無機鹽，用稀硫酸調節好酸度，冷卻至常溫即制成平板分離用的固體培養基。

1.7.2.2　修復微生物的連續擴大培養

試驗與生產實踐證明，修復細菌的濃度和活性對吸附降解效果有很大影響。為了研究和生產需要，有時要在短時間內培養出大量符合要求的菌液。大量培養的方法有兩種，一種是間斷的，一種是連續化的。連續培養效率高于間斷培養。以生產中常用的氧化亞鐵硫桿菌為例介紹該菌的連續培養過程。通常用含有Fe2+的培養基培養氧化亞鐵硫桿菌，培養過程中細菌的繁殖數量或濃度的變化與培養液中Fe2+被氧化的量成正比，為使細菌快速繁殖，需滿足以下細菌生長的最優化條件[5]。

①提供細菌生長繁殖所需的營養物質，通過試驗確定最佳化培養基配方；

②提供細菌生長所需的足夠量O2和CO2；

③控制好細菌生長所要的酸度和溫度；

④提供最優菌種和足夠的菌種量，為加快培養速度，可適當加大接種量，一般接種量為10%～20%。

在培養過程中，要盡量縮短細菌開始生長的緩慢期，盡快進入對數生長期。培養到一定程度的細菌，在使用前須知道所培養菌液中細菌的含量或濃度，要對培養槽生產的菌液進行計量。細菌計量一般有如下幾種方法：比濁法、直接計數法、平皿計數法、稀釋法。其中比濁法和直接計數法可計量出一定體積菌液內所含細菌的總數，此總數包括活菌和死菌，而平皿計數法和稀釋法測定的是單位菌液體積內的活菌數。

1.7.2.3　修復微生物的馴化

修復微生物在使用之前要進行馴化，使之適應于吸附過程中可能對細菌不利的工藝條件或對于細菌具有毒害作用的物質成分。馴化的辦法是逐漸變化不利因素強度之后對細菌進行轉移培養，在馴化過程中，那些對新環境不適應的細菌受到抑制或死亡，而某些活力較強的細菌會通過變異等途徑，演變成耐受性更強的細菌而活下來，形成對新環境具有耐性的菌株。例如培養細菌耐砷的能力的方法是：首先在裝有一定體積培養基的三角瓶中加入較低濃度的砷離子，然后接種入要馴化的細菌進行培養，開始時細菌不適應，要較長時間才能生長繁殖，待細菌適應于此濃度砷的環境開始正常生長后，將它轉移到含更高濃度砷的培養基中繼續培養。依此類推，每轉移一次都提高砷的濃度，經過多次逐漸加大砷的濃度的轉移培養，就可以獲得對砷具有較強耐受力的菌株。據報道，國外有人通過馴化獲得了可耐受25g/L砷的菌株。

1.7.3　修復微生物菌種的采集和分離培養

取50～250mL細口玻瓶，洗凈并配好膠塞，用牛皮紙包好瓶口，置于120℃烘箱滅菌20min，冷卻后即可用作細菌采集瓶，帶采集瓶到需修復的水樣中。取樣時首先將牛皮紙取下，用一只手拔去瓶塞，另一只手持瓶接取或舀取水樣，水樣不能裝滿，須留一定空間存空氣。取好樣后立即蓋好瓶塞并用牛皮紙包好瓶口，帶回實驗室。

在實驗室將配好的細菌培養基用蒸汽滅菌15min，然后在無菌操作條件下將培養基分裝于數個洗凈并無菌的100mL三角瓶中，每瓶裝25mL培養基，然后用洗凈干燥的吸液管取1～5mL水樣加到各三角瓶中，塞好棉塞放在20～35℃恒溫件下靜置或振蕩培養7～10d。由瓶中取1mL培養液，接種到裝有新培養基的三角瓶中同樣培養，至少10次以上，每轉移一次接種量逐漸減少，只需1～2滴就可以，在轉移培養中，借助培養基的高酸度，可殺死淘汰掉一些不耐酸的雜菌。

用上述方法得到的細菌可能是不純的，如要分離純菌種，要做平板分離。但一般生產中使用，不需要純菌種。菌種培養好后，要放在冰箱（4℃）中保存，過一定時間還要取出來重新轉移培養，如用加入重金屬的培養基保存，可在室溫條件下每4～6個月轉移一次即可。

平板分離的目的是獲得從單一細胞培養出來的純菌株。方法是將固體培養基熔化倒入培養皿制成平板，然后在無菌條件下，用接種環取上述培養菌液在平板上劃線，使所取菌液中的菌體細胞盡量沿劃線分散開，然后將劃好線的培養皿在20～35℃條件下恒溫培養，經10d左右就可看到單個菌株長成的很小的菌落，挑選適當菌落用取樣針移到裝有數毫升培養基的小試管中恒溫培養，一般培養7d左右即可。將此培養液重新在固體培養基上劃線培養，如此反復數次分離與培養，就可獲得純菌株。將這些由單一菌落來的培養物分別進行鑒定，具體做法可參見《微生物手冊》。

菌種馴化培養好以后，置于冰箱（4℃）保存，但隔一段時間須重新轉移培養。工業生產用菌需在專門設備中大量培養。