1.4.4　沼液指標分析

水解發生在固相秸稈上，產生的可溶性產物進入沼液發酵產酸。因此，沼液中發酵參數的變化反映了產酸與產甲烷的平衡。常用的監控指標有pH、VFAs、堿度、氨氮濃度、氧化還原電位等，在一些連續運行的反應器中，總VFAs和堿度比（TVFA/TIC）及溶解性有機物（DOM）組分的變化是重要的預警指標。

1.4.4.1　pH

不同的pH會形成不同的生態位，有利于特定菌群的生長。如Hu等[113]的研究表明，接種瘤胃體系纖維素降解效率會隨著pH的提高而增加。而Romsaiyud等[114]的研究表明水解菌最適pH范圍在5.3～8.3之間，過低pH會對水解菌產生離子毒性，降低水解酶活[115]。

甲烷菌最適的pH范圍不同。如中溫發酵中，Methanobacterium最適pH為6.6～7.8，Methanosarcina為6～7，Methanosaeta為7.0～7.5。而嗜熱型甲烷菌的最適pH比中溫高，如Methanothermobacter thermoautotrophicum最適范圍為7.0～8.0[9]，由此可見，甲烷菌的最適pH生態幅度比水解菌和產酸菌要窄。6.5～8.2是大多數研究所采用的產甲烷pH范圍[116]。pH低于該范圍產甲烷活性受到抑制[4]。因此調控pH有利于產甲烷效率的提高，如Yang等[117]研究表明，高固態餐廚垃圾厭氧發酵易引起嚴重的酸化和產甲烷抑制。將pH調為8時，甲烷產率和甲烷含量分別達到了171.0mL/g TS和53.1%，高于未調控組，研究者將pH效應歸因于水解酶活和產甲烷途徑中輔酶F420的提高。

1.4.4.2　總VFAs與堿度比（TVFA/TIC）

秸稈發酵體系VFAs主要包括乙酸、丙酸及丁酸等，它們對體系的影響各不相同。Romsaiyud等[114]的研究表明，乙酸濃度高于1.5g/L會影響纖維素酶的產生，從而導致纖維素水解菌的活性受到抑制。Xiao等[118]在研究乙酸對產甲烷活性影響時發現，乙酸濃度為1619.47mg/L時產甲烷不受抑制，但達到3000mg/L時，活性完全受到抑制。從反應動力學來看，乙酸作為嗜乙酸型甲烷菌和乙酸氧化菌的底物，濃度的高低同樣影響乙酸代謝的途徑[119]。丙酸（或丁酸）是厭氧發酵受抑制的重要指標。OLR提高，丁酸代謝加快，產生的氫和還原力NADH被利用產甲烷，但超過甲烷菌的代謝能力時，通過產丙酸途徑得到釋放[100]。如Ahring等[120]的研究表明，當溫度從55℃升至59℃時，丁酸濃度升高的指標比體系受抑制出現時間提前2d。Deng等[42]在稻秸單瘤胃接種體系中發現，當OLR達到7g/（L·d）時，丙酸的積累標志著產甲烷受到了抑制。

VFAs積累易造成體系酸化，但體系中存在的碳酸鹽、重碳酸鹽及少量氨氮離子緩沖了VFAs對pH的影響，這種能力可以用堿度來表示。根據Raposo等[102]的報道，厭氧體系最理想的堿度范圍為2500～5000mg CaCO₃/L，能緩沖VFAs濃度升高造成的影響，使pH維持在小范圍內變化。由此可見，pH對體系VFAs積累有一定的遲滯性，而TVFA/TIC，也稱FOS/TAC，常用于衡量體系緩沖能力，能及時反映運行狀況。當比值小于0.4，表明產酸與產甲烷達到平衡；比值大于0.8是體系酸化的信號[121]。

1.4.4.3　氨氮濃度

補充的氮源除被厭氧微生物利用外，剩余部分以氨氮離子和游離氨的形式存在于沼液中。高濃度游離氨能以被動擴散的方式自由透過細胞膜進入細胞，與K+發生交換，破壞K+依賴型ATP離子泵，從而對厭氧菌產生毒害[116，122，123]。游離氨濃度的計算如公式（1.1）所示：

　　（1.1）

式中，FAN為游離氨濃度，mg/L；TAN為總氨氮濃度，mg/L；pK_a是氨氮的解離常數；T為溫度，℃。

由此可見，游離氨的濃度受總氨氮、pH和溫度的影響；當總氨氮濃度相同，高溫發酵（50～55℃）中游離氨濃度大約是中溫發酵（35～40℃）的6倍。因此高溫發酵更易受到氨氮抑制[92]。研究表明，氨氮濃度在200mg/L就能保證厭氧微生物生長的需要[93]；1500mg/L氨氮濃度作為抑制的閾值，對厭氧發酵有抑制作用；中溫、pH 7.6條件下，超過3000mg/L閾值會對產甲烷活性產生顯著抑制[93，124]。但研究也表明，活性污泥經過馴化，氨氮抑制的閾值濃度可以達到5000mg/L以上[123，125]。

甲烷菌受氨氮抑制的機制不同。如Methanosarcina是不規則的球菌，常形成包囊或聚合體，而Methanosaeta呈棒狀結構，形態特征的不同決定了Methanosarcina比Methanosaeta對氨氮的耐受濃度更高[9]。如Calli等[76]在運行中溫UASB反應器時，游離氨濃度達到100mg/L時，Methanosaeta喪失產甲烷活性，絲狀結構受到破壞，Methanosarcina反而成為優勢菌群。氨氮對嗜乙酸型和嗜氫型甲烷菌的影響有不同的報道。如Sprott等[122]研究認為游離氨進入嗜氫型甲烷菌（如Methanobrevibacter、Methanobacterium）細胞內部破壞K+平衡，比Methanosarcina更易受到氨氮影響。但也有報道認為，嗜乙酸產甲烷途徑在高氨氮條件下受到抑制，一些對耐受性強的嗜氫型伴生菌（如Methanoculleus、Methanothermobacter）能形成互營氧化菌群發揮作用[125，126]。如在市政分選垃圾中溫發酵中，當總氨氮濃度達到3000mg/L時，乙酸互營氧化逐漸成為主要產甲烷途徑[126]。上述研究表明，還原氫通過乙酸互營氧化途徑得到釋放，是厭氧微生物應對氨氮抑制的重要適應性機制。

1.4.4.4　DOM中熒光組分分析

DOM主要包括來源于接種物的有機質、秸稈降解副產物及微生物代謝物等成分，會對厭氧發酵產生影響[127]。很多有機物都有特定的三維熒光峰，可以利用三維熒光光譜技術（excitation-emission matrix, EEM）來測定。

如污泥和環境水樣中包含可溶性腐殖質，它們的熒光峰在一定熒光范圍內出現，如根據Chen等[128]的劃分，激發波長（Ex）＜250nm，發射波長（Em）＞350nm范圍（Ⅲ區）屬富里酸類物質；Ex＞280nm，Em＞380nm范圍（Ⅴ區）屬腐殖酸類物質。一些微生物代謝物也具有特定熒光峰。如280nm/340nm（Ex/Em）熒光峰是蛋白質芳香族氨基酸結構（色氨酸或酪氨酸）的特征峰，一般認為是微生物代謝產物或在衰亡自溶中產生[129]；340nm/430nm（Ex/Em）是輔酶NADH的特征峰[130-132]；輔酶F420是嗜氫型產甲烷代謝獨有的電子載體，特征峰位于420nm/470nm（Ex/Em）[125，130]。

由于熒光強度能反映熒光組分濃度的變化[133]，熒光峰可用于特征熒光物質的監控。如LI等[134]利用三維熒光光譜-平行因子分析技術（excitation-emission matrix and parallel factor analysis, EEM-PARAFAC）研究脫水污泥的厭氧消化過程，識別出腐殖酸類（humic-like）、富里酸類（fulvie-like）以及蛋白類熒光峰，根據熒光強度的變化，得出蛋白和腐殖酸類物質的降解順序；發現腐殖酸類物質能競爭抑制嗜乙酸產甲烷活性，造成VFAs的積累[135]。劉怡心等[136]通過EEM-PARAFAC技術識別出了厭氧氨氧化反應器中富里酸類特征峰，而且還利用熒光代謝物表征反應器運行指標。Sabatini等[131]在中溫厭氧產氫反應器出水中，解析出代謝物熒光蛋白和NADH。李衛華等[132]應用EEM表征了高溫厭氧反應器的出水，采用PARAFAC法識別出3種熒光組分（蛋白類、輔酶NADH和核黃素），它們與反應器的運行密切相關。