1.4.5　菌群的分子生物學診斷

已有的研究表明，復雜環境微生物分離純化困難，絕大多數屬“未培養菌”。為此，基于16S rDNA（原核生物）、18S rDNA（真核生物）及特定功能基因的分子生態學手段被廣泛應用，提高了厭氧發酵診斷的效率和準確性。其中，遺傳指紋技術是研究菌群結構及動態變化的常規手段，但由于不能進行定量分析，需要與穩定性同位素標記（stable-isotope probing，SIP）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）及定量PCR（quantitative polymerase chain reaction, q-PCR）等技術結合，監控特定菌群[42]。高通量測序技術（NGS）將為厭氧發酵診斷提供新的選擇，環境基因組學（metagenomics）被用于厭氧菌群結構分析、功能活性及環境微生物相互作用研究[91，137，138]。而轉錄組學（metatranscriptomics）、代謝組學（metabolomics）及蛋白組學（metaproteomics）則可以在轉錄、功能蛋白表達水平更好地診斷菌群的代謝活性。

SIP原理是利用穩定同位素（13C或15N）標記代謝物，通過一系列分離獲得被標記分子，如微生物膜磷脂和rDNA（或rRNA）。除了用于互營氧化菌的鑒定外，還可以對外源微生物的定植和代謝進行分析。如利用13C標記纖維素，發現瘤胃水解菌無法和市政發酵污泥菌群競爭，從反應器中消失[139]。同樣用13C標記纖維素，Li等[140]檢測到Acetivibrio是參與纖維素水解的主要菌屬。

q-PCR通過檢測熒光的循環數（Ct），來定量樣品中特定基因的拷貝數。由于產甲烷活性受環境條件影響顯著[141]，因此定量分析甲烷菌數量及活性是研究體系微生物機理的有效手段。首先，不同的環境條件有特定的甲烷菌類型，如氨氮濃度的升高，水力停留時間的縮短、乙酸濃度的增加等環境因素使Methanosaeta產甲烷活性減低，適應能力強的Methanosarcina種屬成為優勢菌群[76]。而當OLR過載時，VFAs濃度升高，會導致互營氧化伴生菌（如Methanospirillum hungatei、Methanoculleus receptaculi）取代Methanosarcina成為主導類型[100]。Munk和Lebuhn[142]在中溫青貯玉米發酵的研究中，發現甲烷菌及轉錄活性的變化比TVFA/TIC指標預警反應器酸化提早了一個月。在穩定階段，嗜氫型Methanoculleus sp.是主要甲烷菌類型；在酸化階段，適應性更強的Methanosarcina sp.成為主要產甲烷類型。其次，不同的溫度條件決定了甲烷菌類型的變化[9]。如Lee等[105]發現高溫優勢甲烷菌為Methanoculleus，但pH升高，Methanothermobacter成為主要菌屬；而中溫條件下，嗜乙酸型Methanosaeta是主要類型。再者鐵（Fe）、鎳（Ni）、鈷（Co）等金屬是產甲烷過程的重要輔因子，影響甲烷菌的類型和活性，金屬元素的缺乏被認為是秸稈沼氣反應器運行不穩定的重要原因之一[143]。如Fermoso等[144]在分析Co缺乏條件下甲醇厭氧發酵的研究中，發現Co缺乏使產乙酸比嗜甲醇型產甲烷代謝更有熱力學優勢，在10d內污泥中Methanosarcina消失，產甲烷活性減少，最終導致反應器酸化。Gustavsson等[145]在富硫酒糟厭氧發酵時，發現甲烷菌群結構受Ni和Co可利用態濃度影響，可以作為體系運行的監控指標。當Ni和Co投加時，Methanosarcinales占主導地位，當Ni和Co缺乏時，VFAs濃度增加，Methanomicrobiales豐度升高。