第一節 乳酸菌及代謝
一、乳酸菌的種類
與果酒蘋果酸-乳酸發酵相關的乳酸菌分布于兩科四屬：乳桿菌科的乳桿菌屬，該細菌細胞呈桿狀，革蘭陽性。鏈球菌科的酒球菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬，這三個屬的乳酸菌細胞呈球形或球桿形，革蘭陽性。在眾多乳酸菌中，酒類酒球菌是最重要的乳酸菌，而且是唯一在低pH(pH<3.5)下誘導MLF的乳酸菌。有害的乳酸菌一般是乳桿菌與片球菌。
按照乳酸菌對糖代謝途徑和產物種類的差異，可以把它們分為同型乳酸發酵細菌和異型乳酸發酵細菌，分別進行同型和異型乳酸發酵。異型乳酸發酵是指葡萄糖經發酵后產生乳酸、乙醇(或乙酸)和CO2等多種產物的發酵；同型乳酸發酵是指產物中只生成乳酸的發酵。
乳酸菌中，用于蘋果酸-乳酸發酵商業發酵劑的細菌只有酒類酒球菌和植物乳桿菌，其中酒類酒球菌發酵劑最為常用。片球菌也能進行蘋果酸-乳酸發酵，但該屬細菌發酵時，容易引起葡萄酒的變質，因此通常認為是一類有害乳酸菌。當果酒的pH低于3.5時，其他種類的乳酸菌生長受到抑制，酒類酒球菌處于主導地位；而當pH高于3.5時，乳桿菌和片球菌便會快速繁殖，并能引起果酒的乳酸菌病害。
1．乳桿菌屬
該屬為革蘭陽性、微好氧、在顯微鏡下呈長桿、短桿或球桿狀的細菌，通常過氧化氫酶陰性，經己糖代謝途徑進行同型或異型乳酸發酵。乳桿菌對酸的忍耐性很強，適宜于在酸性條件(pH 5.5～6.2)下啟動生長，通常5% CO2促進生長。在營養瓊脂上的菌落凸起、全緣和無色，直徑2～5mm。化能異養菌，需要營養豐富的培養基；發酵分解糖代謝，終產物中50%以上是乳酸。最適生長溫度30～40℃。廣泛分布于環境，特別是動物、蔬菜和食品中。在世界各地葡萄和葡萄酒中分離出的乳桿菌包括同型發酵類型，如干酪乳桿菌、植物乳桿菌、米酒乳桿菌、同型腐酒乳桿菌以及異型發酵類型，如短乳桿菌、希氏乳桿菌、食果糖乳桿菌、布氏乳桿菌和發酵乳桿菌等。
2．明串珠菌屬
明串珠菌屬革蘭陽性，細胞為球形或雙凸透鏡形，通常成對或成短鏈。有些菌株形成莢膜。生長要求包括適當的糖類和一系列維生素，如生物素、硫胺素、煙酸和葉酸。葡萄糖通過異型乳酸發酵而代謝，形成乳酸和乙醇或醋酸。最適生長溫度約25℃。大多數細菌不能在葡萄酒pH條件下生長，只有腸膜明串珠菌偶然出現。
3．酒球菌屬
酒球菌屬以前被劃入明串珠菌屬，酒類酒球菌革蘭陽性，不運動，兼性厭氧，過氧化氫酶陰性，橢圓體或球形，通常成對或鏈狀出現。在顯微鏡下很難與呈短桿狀的桿菌區分，嗜酸。生長于pH 3.5～3.8葡萄汁和果酒中，在起始pH4.8的條件下生長更好。10%(體積分數)乙醇不抑制其生長。最適生長溫度22℃。在15℃生長緩慢。有可發酵的碳水化合物時，可將蘋果酸鹽轉變成L-(＋)-乳酸鹽和CO2。代謝不活躍，僅發酵少數幾種碳水化合物。喜好果糖，通常發酵海藻糖。在葡萄汁或果酒中發酵戊糖(阿拉伯糖或木糖)，因此導致二次生長現象。異型發酵，基本上將葡萄糖發酵成等摩爾的D-乳酸、CO2和乙醇或醋酸鹽。目前只包括一個種，即酒類酒球菌，它是目前啟動果酒蘋果酸-乳酸發酵最重要、應用最廣泛的乳酸菌。酒類酒球菌為異型乳酸發酵菌，絕大多數菌株利用L-阿拉伯糖、果糖、核糖，但不能利用半乳糖、乳糖、麥芽糖、松三糖、棉子糖、木糖。酒類酒球菌能夠利用葡萄酒中的蘋果酸生成乳酸。
需要說明的是，酒球菌過去定名為酒明串珠菌。在報道的明串珠菌屬的種中，酒明串珠菌是唯一嗜酸的一個種，來源于酒和有關的環境。這個種的菌株與其他明串菌屬的種，在許多方面的特性不一致。它們可生長于初始pH4.8和含體積分數10%的乙醇培養基中，絕大多數菌株需要一種番茄汁生長因子。它們缺乏葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，D-乳酸脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和乙醇脫氫酶的電泳遷移率都明顯不同于其他種。酒明串珠菌的全細胞可溶性蛋白圖譜與其他種也不一樣。在基因型遺傳方面的研究結果，也進一步證明酒明串珠菌與其他種不同，這個種與其他種的DNA-DNA同源性都低。DNA-RNA雜交和rRNA序列分析也顯示了酒明串珠菌的特別之處，尤其是16SrRNA序列分析和23SrRNA序列研究顯示，這個種與明串珠菌屬其他種在親緣上不相關，完全屬于另一分支，鑒于以上表現型和遺傳型與明串珠菌屬其他種的明顯差異，有人提出應將這個種列為一個新屬，稱為酒球菌屬；將酒明串珠菌重新分類，定名為酒球菌。這一提法，得到學術界的普遍認同。
4．片球菌屬
片球菌細胞球形，直徑1.2～2.0μm。在適宜條件下，在直角兩個平面交替分裂形成四聯狀，一般細胞成對生，單個細胞罕見，不形成鏈狀，不產芽孢，革蘭陽性，不運動。兼性厭氧，有的菌株在有氧時會抑制生長。觸酶陰性，氧化酶也陰性。最適生長溫度25～40℃。該屬菌同型乳酸發酵，發酵糖類(主要是單糖和雙糖類)，葡萄糖產酸不產氣，將葡萄糖轉化成L-或DL-乳酸。葡萄糖受限時，戊糖片球菌降解甘油生成丙酮酸，后者經“活性醛途徑”進一步分解成乙酸、雙乙酰或2，3-丁二醇。片球菌是化能有機營養生物，需要復雜的生長因子和氨基酸。
在葡萄酒中總共分離出3種片球菌：有害片球菌、小片球菌和戊糖片球菌。有害片球菌和小片球菌更為常見。
二、影響酒類酒球菌生長的因素
酒類酒球菌是使蘋果酸-乳酸發酵能夠順利進行的最重要的啟動者，也是在果酒的嚴峻生境中耐受性最強的菌種，果酒中乙醇濃度、SO2含量、pH值、溫度都是制約酒類酒球菌生長的重要因素。
1．乙醇的影響
酒類酒球菌是革蘭陽性細菌，沒有完整的細胞結構，直接由細胞膜包被，所以細胞膜是其抵御不利環境的第一道屏障，在受到脅迫反應時，為避免影響細胞新陳代謝的正常進行，細胞膜物理特性和流動性需要不斷調整，以維持其屏障作用和酶活性。乙醇脅迫主要影響酒類酒球菌細胞膜的結構和功能，研究顯示，隨著乙醇濃度的升高，細胞膜的流動性和通透性增加，質子或其他離子的透過率增加，致使能量轉化效率降低。隨著乙醇處理時間的延長，細胞存活率顯著降低，不同乙醇濃度對細胞的影響出現明顯差異。處理時間30min時，14%乙醇處理會使菌體細胞發生不可逆的硬化，而10%和12%乙醇處理發生的硬化是可逆的，當脅迫條件移除時細胞膜會恢復至初始狀態。
處理時間相同時，細胞存活率隨著乙醇濃度的增加而降低，即乙醇濃度越高對細胞活力的影響越大。也有研究指出，當環境中存在10%乙醇或更少量乙醇(3%～5%或7%)時，可促進菌體的生長，當酒精濃度高于12%時，將顯著抑制酒類酒球菌的生長。
2．溫度的影響
酒類酒球菌的細胞經低溫處理后，細胞膜中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比率上升，而膜中環丙烷脂肪酸的含量增加，同時，細胞膜的流動性大大降低。研究發現細胞在經低溫處理后，細胞膜會發生明顯的硬化現象，且溫度越低其硬化現象越明顯，然而其細胞活力未受到明顯影響。細胞經短時間低溫處理后，將溫度回升至原來溫度時，其細胞膜的流動性也會恢復至原來狀態，且細胞膜及蛋白質組分并未發生明顯變化。即低溫脅迫會影響細胞膜中脂肪酸及蛋白質組分，卻不影響細胞的存活率，且此過程是可逆的。低溫不僅會影響細胞膜的流動性，更會使得細胞內的酶活性暫時降低，抑制了細胞內各種生化反應的進行，當溫度回升，這種抑制作用便會解除。
高溫會增加細胞膜的流動性及通透性，甚至導致細胞內代謝物流出，溫度過高時會影響細胞膜中的酶活性，進而影響細胞的存活率。在42℃條件下培養細胞時，菌體的生長明顯受到抑制，且高溫脅迫誘導了脅迫蛋白的合成。這種機制使得酒類酒球菌細胞能夠存活并繁殖。并且酒類酒球菌細胞經42℃處理后直投入果酒中發酵可明顯提高細胞在果酒中的存活率以及誘發蘋果酸-乳酸發酵順利進行的能力。酒類酒球菌細胞受到高溫脅迫時，細胞內的熱休克蛋白含量增加。
3．酸的影響
酒類酒球菌生長的最適pH值為4.8～5.5，而果酒的pH值通常偏低，即對酒類酒球菌而言是一個低pH值的脅迫環境，pH值的高低決定蘋果酸-乳酸發酵是否能夠順利進行。當pH值較低時，酒類酒球菌細胞膜中乳桿菌酸的含量顯著增加。乳桿菌酸有利于維持細胞膜的完整性及穩定性。酒類酒球菌在酸脅迫條件下時，能誘導膜上H＋-ATP酶的活性增強。該酶不僅在蘋果酸-乳酸發酵過程中發揮作用，而且在抗酸機制中也發揮重要作用。H＋-ATP酶可耦合ATP水解，將質子排除細胞外，從而調節細胞內外的pH值，以維持細胞膜特性，保證細胞的正常生長。
三、乳酸菌糖代謝及風味物質的形成
大多數果酒經酒精發酵結束后都含有殘糖，濃度很低，比如己糖(葡萄糖和果糖)以及戊糖(核糖、阿拉伯糖和木糖)，這些糖均能被乳酸菌所代謝。乳酸菌能利用己糖以及戊糖，經過分解代謝產生乳酸、醋酸、丙酸等有機酸，有些可直接作為風味物質或是重要風味物質的前體。在發酵過程中，乳酸菌同型發酵代謝糖類主要產生乳酸，異型發酵代謝產生乳酸、乙醇及二氧化碳等發酵產物，也產生乙醛、丙酮、乙偶姻、雙乙酰等多種揮發性芳香化合物，促進良好風味的形成。葡萄糖經過己糖的磷酸化、磷酸己糖的裂解、氧化脫氫等糖酵解步驟生成ATP及中間代謝產物丙酮酸，丙酮酸往往是后續反應的起點，最終釋放出不同的香味和味覺活性化合物。主要有以下6種途徑。
① 丙酮酸在乳酸脫氫酶(LDH)的作用下直接還原成乳酸。
② 丙酮酸在丙酮酸脫羧酶(PDC)的作用下生成乙醛，乙醛在雙乙酰合酶的作用下生成雙乙酰。
③ 在α-乙酰乳酸合成酶(ALS)的作用下生成α-乙酰乳酸，可經氧化脫羧生成重要的食品風味物質雙乙酰；此外α-乙酰乳酸還可以在α-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)催化下生成另一重要的風味化合物乙偶姻。
④ 丙酮酸在丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)的催化作用下轉化成乙酰CoA，繼而在乙醛脫氫酶(ALDH)的作用下生成乙醛，乙醛在乙醇脫氫酶(ADH)的作用下生成乙醇。
⑤ 葡萄糖先經過磷酸戊糖途徑(HMP)生成乙酰磷酸和3-磷酸甘油醛并釋放二氧化碳，乙酰磷酸在乙酸激酶(AK)作用下產生終產物乙酸，3-磷酸甘油醛的終產物為乳酸。
⑥ 丙酮酸脫羧形成的乙酰CoA，另外一條去路是與草酰乙酸在檸檬酸合酶催化下生成檸檬酸，進入三羧酸循環(TCA)，進而生成琥珀酸、蘋果酸等有機酸。此外，草酰乙酸在草酰乙酸脫羧酶(OAD)的作用下經過脫羧反應生成丙酮酸，丙酮酸可進一步轉化成乳酸。
蘋果酸-乳酸菌可以分解代謝檸檬酸生成乳酸以及雙乙酰、乙偶姻等風味物質，對果酒的感官品質具有重要影響。在低pH值條件下，當基質中無可發酵糖時，蘋果酸-乳酸菌幾乎不分解檸檬酸，而當有可發酵糖存在時，乳酸菌對檸檬酸和葡萄糖的分解代謝速度都提高，乳酸菌生長比率與生長量均明顯增大。因此，乳酸菌對檸檬酸-葡萄糖進行著共代謝。共代謝首先在乳品發酵過程中得到研究和證實，并已證明這種現象也存在于蘋果酸-乳酸發酵過程中。在檸檬酸-葡萄糖共代謝途徑中，兩者的影響是相互的。檸檬酸刺激了細菌對糖的代謝，提高了乳酸菌生長量和生長速率。糖代謝也改變了檸檬酸的代謝途徑，檸檬酸進入細胞后，在檸檬酸裂解酶的作用下分解成乙酸和草酰乙酸；后者脫羧生成丙酮酸，在糖代謝產生的NADH2的作用下，被還原生成乳酸，使共代謝過程中，檸檬酸代謝產物中乳酸產率提高。
不同屬的蘋果酸-乳酸菌及同屬的不同菌株，發酵特性均不相同，酒類酒球菌在蘋果酸-乳酸發酵期間，檸檬酸的降解與蘋果酸的降解相比被延遲，檸檬酸代謝最主要的呈香副產物是雙乙酰及其衍生物乙偶姻，生成的雙乙酰的含量在其閾值范圍之內(小于5mg/L)，有利于葡萄酒風味復雜性的形成，對酒香有一定的增進作用；當其含量超過閾值時，就會使酒出現奶油味，破壞酒的香氣。一般果酒中雙乙酰的最終濃度取決于SO2濃度。
四、乳酸菌氮代謝及生物胺的形成
在蘋果酸-乳酸發酵過程中，由于乳酸菌的生長代謝，精氨酸在蘋果酸-乳酸發酵后濃度下降，而鳥氨酸的濃度上升。有些氨基酸在乳酸菌的作用下發生脫羧反應產生生物胺(如組胺和色胺)。已經證明，酒球菌和片球菌屬的細菌都能產生生物胺。在發酵食品如酸奶、發酵香腸、泡菜及果酒中，大都含有生物胺。胺在生物活性細胞中具有重要的生理功能。但當人體吸收過量的生物胺時，可能會引起頭痛、呼吸紊亂、心悸、血壓變化等過敏性反應。生物胺在人體細胞內會被一些酶促代謝反應降解，但酒精和乙醛能抑制這些酶的活性。
1．精氨酸
精氨酸具有苦味、霉味，通過細菌對精氨酸的降解，有助于消除這些異味，同時還可以從一定程度上提高酒的pH，從而提高了酒的感官品質，產生的鳥氨酸還有抑制野生酵母的作用。但是代謝產物瓜氨酸可作為生成致癌物質——氨基甲酸乙酯的前體物，嚴重影響果酒的飲用安全性。精氨酸代謝研究日益受到重視。
直至20世紀90年代，研究者仍對蘋果酸乳酸菌的精氨酸代謝途徑存有爭議。一種說法是酒類酒球菌精氨酸代謝途徑是尿素循環途徑：精氨酸在精氨酸酶的作用下轉化成鳥氨酸和尿素，隨后鳥氨酸在鳥氨酸轉氨甲酰酶的作用下轉化成瓜氨酸；尿素在脲酶的作用下生成氮和二氧化碳。但劉芳在精氨酸代謝實驗中發現，在整個細菌培養過程中并沒有檢測到尿素，并且在細菌的無細胞抽提物中也沒有檢測到精氨酸酶和脲酶的活力。因此，可以肯定蘋果酸乳酸菌對精氨酸的降解不是尿素循環途徑。在實驗中，他們也發現，精氨酸經布氏乳桿菌分解后生成的瓜氨酸又被細胞同化，并且隨著瓜氨酸含量的降低，鳥氨酸含量上升。這表明，瓜氨酸是鳥氨酸的前體，而不是鳥氨酸的降解物。并且在酒類酒球菌等的無細胞抽提物中，檢測到了與蘋果酸乳酸菌的精氨酸代謝有關的3個關鍵酶：精氨酸脫亞氨基酶、鳥氨酸轉氨甲酰酶和氨基甲酰激酶，提出了蘋果酸-乳酸菌的另一種途徑，精氨酸代謝的脫亞胺途徑。
2．生物胺
由于蘋果酸-乳酸菌的生長代謝，會使酒中的氨基酸含量發生顯著變化。某些氨基酸在葡萄酒蘋果酸-乳酸菌相關酶的作用下發生脫羧反應，可生成相應的胺類化合物。組胺的產生不僅與菌株特性有關，也取決于前體物的數量及存在的酵母菌皮的作用，這些因素增加了介質中組氨酸的含量。控制細菌生長速率和總生物量的乙醇、pH也是很重要的因素。低pH和低乙醇濃度促進組胺的產生，特別是在營養最貧乏(無葡萄糖、無L-蘋果酸)的條件下，可能會導致組胺的大量產生。
乳酸菌對氨基酸脫羧產生生物胺需要兩個基本條件：一是乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活力，不同種間和菌株間的乳酸菌，氨基酸脫羧能力差異很大；二是基質中有足夠的氨基酸。因為酵母在酒精發酵過程中改變了果汁中的含氮化合物的組成，它們能夠利用有些氨基酸，也能通過酵母的自溶作用釋放一些氨基酸。在酒精發酵結束后與酵母酒腳一起貯存，酵母自溶釋放的多肽和游離氨基酸能夠被乳酸菌水解和脫羧，這也解釋了為什么帶酒腳貯存的果酒中生物胺含量通常較高的原因。
蘋果酸-乳酸發酵結束后，酒中所有的乳酸菌都變成了有害菌，乳酸菌群體數量并不迅速下降，應及時除去，以防止乳酸菌利用氨基酸生成生物胺。可以采用的工藝方法如下：
①添加足夠的SO2。蘋果酸-乳酸發酵結束后立即調整SO2至100mg/L或游離SO2至30mg/L。較高濃度的SO2可以抑制乳酸菌的生長，該方法簡單、有效，在生產上廣為采用。②盡早下膠、倒罐、去酒腳、澄清或進行瞬時高溫滅菌。③在15℃左右低溫貯酒。④添加化學抑制劑，美國允許在葡萄酒中添加富馬酸(0.5g/L)抑制細菌的生長；添加細菌素，乳酸鏈球菌素、植物乳桿菌素和片球菌素可以抑制乳酸菌的生長。酒類酒球菌對乳酸鏈球菌素非常敏感，5U/mL的乳酸鏈球菌素可完全抑制其生長，植物乳桿菌素可以抑制多種乳酸桿菌，片球菌素可以抑制片球菌。⑤添加溶菌酶。該酶對乳酸菌具有很好的溶菌效果，隨著pH的增加，酶活增強，使用溶菌酶可以降低SO2的用量而且不影響果酒的感官質量。溶菌酶的用量為125～500mg/L。
細菌素是某些細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產生的一類具有生物活性的前體多肽、多肽或蛋白質，當其達到一定數量時可以抑制或殺滅與之相同或相似的其他微生物，通常其所產細菌素不會對菌體本身造成傷害。乳酸菌通常被認為一般公認安全，而且大多數的產細菌素乳酸菌來源于天然食品，因此乳酸菌細菌素更適合在食品中應用，具有良好的pH穩定性、熱穩定性及對酸、鹽、酶的耐受性，乳酸菌細菌素具有高效、廣譜、安全等優點，能有效地抑制食品中的致病菌和腐敗菌，是一種具有巨大應用潛能的生物防腐劑。
五、乳酸菌與其他微生物間的相互作用
接種的乳酸菌會與其他細菌(pH條件有利于其生存生長)相互作用。這些細菌會產生細菌素(如對乳酸菌有毒害作用的多肽或蛋白質)，嚴重阻礙蘋果酸-乳酸發酵的進行。酵母菌與乳酸菌之間存在的拮抗作用主要通過對營養物的競爭和分泌抑菌物質(如SO2、中鏈脂肪酸或多肽)來實現。這種抑菌效應取決于果酒中天然存在脂肪酸的含量，較低pH會增強拮抗作用。此外，酵母還會通過自溶作用產生一些刺激蘋-乳發酵的代謝物，因此，利用酵母菌和乳酸菌之間的相互作用成為蘋-乳發酵至關重要的一步。酵母的營養需求越大，消耗發酵醪中的營養物越多，對乳酸菌的接種和存活影響越大。酒精發酵結束后補充半胱氨酸和谷胱甘肽能夠刺激乳酸菌的生長。另外，酒精發酵過程中補充均衡復雜的營養組分(含氨基酸)會延緩酵母對氮源的同化作用，抑制酵母對發酵醪中氨基酸的過度消耗，為乳酸菌生長保留充足的重要氨基酸組分。法國拉曼集團通過研究不同微生物之間的相互作用，研究出困難條件下或針對不同葡萄品種最適合的酵母和乳酸菌組合，接種采用YSEO工藝流程，一種特殊酵母生產流程，此工藝的目標是使發酵更安全，優化提升葡萄酒感官品質，尤其可以提高酵母在發酵時對外界不良條件的抵抗力，如高酒精度，從而保證發酵順利啟動、安全結束，并產生更多有益的組分，降低不良副產物。此工藝生產的酵母菌后，更易于觸發蘋-乳發酵，促進乳酸菌的生長。國內有酒廠使用YSEO酵母與乳酸菌同時接種，能進一步縮短蘋-乳發酵時間，效果顯著。這主要是由于在困難條件下能徹底發酵的YSEO酵母對營養物需求較低，釋放的抑菌物質(如SO2)較少。
六、乳酸菌的新陳代謝
乳酸菌的新陳代謝有以下3個階段，每個階段呈現不同的特性。
① 細胞繁殖階段 利用糖作為能量來源。此時，不消耗蘋果酸或檸檬酸，但卻產生一定的醋酸。
② 穩定階段Ⅰ 乳酸菌不利用糖，蘋果酸被轉化成乳酸。此時，既不分解檸檬酸，也不產生醋酸。
③ 穩定階段Ⅱ 此時既不降解糖，也不分解蘋果酸，但乳酸菌消耗檸檬酸生成丁二酮。要阻止或控制此階段的發生和進行，可以通過加入SO2或溶菌酶來實現。