第二節 蘋果酸-乳酸發酵
蘋果酸-乳酸發酵對不同類型的果酒的作用是不同的。酸度高且蘋果酸含量高的果酒進行蘋果酸-乳酸發酵可降低酸度，改善風味；酸度低的果酒進行蘋果酸-乳酸發酵會使酒變得過于淡薄，應避免此種情形的發生。釀造果香突出的果酒一般不進行蘋果酸-乳酸發酵，以免影響酒的清新感。蘋果酸-乳酸發酵將果酒中具有尖酸口味特征的蘋果酸降解為酸味溫和的乳酸并釋放出CO2。
一、蘋果酸-乳酸發酵的機理
蘋果酸是大多數果酒中的固定酸之一，其生理代謝活躍，極易被乳酸菌分解利用。MLF就是蘋果酸-乳酸細菌分解酒中L-蘋果酸產生L-乳酸并釋放出CO2的過程。通常菌體密度達106CFU/mL時，蘋果酸開始被分解，細菌數達107～108CFU/mL時，蘋果酸被大量分解。根據對微生物體內酶的認識及酶所催化的反應機制研究，參與MLF過程中蘋果酸向乳酸的轉變的酶可能有：蘋果酸-乳酸酶(MLE)、蘋果酸酶(ME)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、草酰乙酸脫羧酶(OADC)、乳酸脫氫酶(LDH)、煙酰胺核苷酸轉氫酶(NNTH)等。
在細胞體內，所有構成代謝的生化反應只有在具有必需的酶類條件下才可能進行。酶的最基本的特性之一，就是對反應底物和所催化的反應種類的特異性。所以，如果知道某一轉化的特性，就可能確定這一轉化機理，根據對生物(包括微生物、植物和動物)酶的認識，MLF的轉化途徑曾被認為是按以下2種方式進行的。
途徑1：蘋果酸→草酰乙酸→丙酮酸→乳酸。在這一反應鏈中，需要3種酶，即蘋果酸脫氫酶(MDH)、草酰乙酸脫羧酶(OADC)和乳酸脫氫酶(LDH)。
途徑2：蘋果酸→丙酮酸→乳酸。這一途徑中需要在多數生物中發現的蘋果酸酶的作用，它可將蘋果酸直接脫羧轉化為丙酮酸；丙酮酸在LDH作用下被還原為乳酸。
已經證明，蘋果酸-乳酸菌(MLB)具有2種乳酸脫氫酶：L-乳酸脫氫酶(L-LDH)和D-乳酸脫氫酶(D-LDH)，按以上的轉化途徑，丙酮酸將生成L-乳酸和D-乳酸2種產物。事實上，MLB在己糖發酵中，D-LDH、L-LDH的確能夠將丙酮酸還原，生成D-乳酸、L-乳酸。而MLF過程中L-蘋果酸只被轉化成L-乳酸，甚至一些沒有L-LDH只有D-LDH的突變MLB菌株進行MLF時也只產生L-乳酸。因此。LDH可能與MLF過程中L-蘋果酸向L-乳酸的轉化無關。這也表明MLF不可能經過丙酮酸途徑。目前的觀點認為，MLF是L-蘋果酸在MLE催化下直接轉變成L-乳酸的過程。這一途徑可以表示如下：L-蘋果酸→L-乳酸＋CO2。
從腸膜明串珠菌中分離純化MLE，該酶為誘導酶，只有當蘋果酸和可發酵糖存在時，細菌才能在胞內合成。MLE為多酶復合體，并與乳酸脫氫酶緊密結合；NAD＋為輔酶，Mn2＋為激活劑。MLE只能將L-蘋果酸轉變成L-乳酸而不生成D-乳酸。草酸銨鹽、1，6-二磷酸果糖、L-乳酸為MLE的非競爭性抑制劑；琥珀酸、檸檬酸和酒石酸為該酶的競爭性抑制劑。
經過MLF，酸味尖刻的二元酸L-蘋果酸轉變為酸味柔和的一元酸L-乳酸，果酒酸度降低，果酒酸澀、粗糙等特點消失，果香、醇香增加，口感改善，質量提高。另外，蘋果酸的生理代謝活躍，易被微生物分解利用，經過MLF還能增加果酒的生物穩定性，并生成雙乙酰和乙偶姻而增加果酒的風味復雜性。
二、影響蘋果酸-乳酸發酵的因素
MLF對環境條件的要求與乙醇發酵相比要苛刻得多，影響MLF的因素包括乳酸菌的營養條件、酒精濃度、二氧化硫濃度、發酵溫度、pH值等，這些因素不同程度地影響MLF的進程。
1．營養條件
MLB比酵母對營養的要求高，要求許多微量元素和生長因子，這就是酵母的降解可以刺激蘋果酸乳酸轉化的原因。和酵母相比，細菌要求一些氨基酸的出現，即它們不能利用氨合成所有20種氨基酸。不同菌株對氨基酸的要求不同。酵母在發酵的后期釋放氨基酸，所以氨基酸的限制不再是一個問題。有觀察到在酵母發酵之前或發酵之后更易發生蘋果酸乳酸轉化，但如果在乙醇發酵活躍期接種，這種轉化很少發生。
除了氨基酸外，乳酸細菌還需要煙酸和泛酸，有時還需要核黃素和吡哆醇；碳水化合物主要是果糖和葡萄糖；Mn2＋、Co2＋、Zn2＋、Mg2＋等是乳酸菌代謝所必需的礦物質；精氨酸對于乳酸菌的生長具有促進作用。
2．酒精濃度
酒精濃度過高會對乳酸菌的新陳代謝產生抑制作用，尤其當酒精度超過了10%(體積分數)，酒精就會變成阻礙乳酸菌生長的重要因子，不同的菌株對酒精濃度的抗性不同。研究表明，12.5%的酒精不僅抑制乳酸菌的生長，還造成乳酸菌的大量死亡。在釀造果酒時，人們常?？紤]在發酵醪酒精度較低時盡早進行蘋果酸-乳酸發酵。酒精度越高，誘導期就越長，酒中的乳酸菌數目也越稀少，蘋果酸分解速度就越慢。
3．二氧化硫濃度
二氧化硫(SO2)對乳酸菌是一個強烈的抑制因子，SO2能夠強烈抑制ATP酶的活性。果酒中的二氧化硫有結合二氧化硫、游離二氧化硫等存在形式，游離二氧化硫比結合二氧化硫對乳酸菌作用強，二氧化硫對蘋果酸-乳酸發酵的抑制作用取決于使用的乳酸菌種、果酒的pH值以及酒中存在的可溶性固形物含量。
一般情況下，總二氧化硫在100mg/L以上，或結合二氧化硫在50mg/L以上，或游離二氧化硫在10mg/L以上，就可抑制果酒中乳酸菌繁殖。
MLB對SO2非常敏感，比酵母敏感得多。所有MLB具有相同的敏感性，酒類酒球菌中沒有耐受性菌株。酵母產生一定量的SO2，產生的亞硫酸鹽量在20mg/L以上，如果pH條件合適，足以抑制MLB的生長。酒類酒球菌對亞硫酸鹽的耐受性達30mg/L，對低pH耐受的菌比不耐受的菌生存得更好。在酸性培養基(pH3.5)中的適應性階段加入亞致死濃度的亞硫酸鹽(15mg/L)，以增加MLB對亞硫酸鹽的適應性。
4．發酵溫度
溫度是影響蘋果酸-乳酸發酵的重要因子。當溫度低于18℃時，蘋果酸-乳酸發酵的速度開始下降；當溫度在5～10℃可阻止蘋果酸-乳酸發酵；而當溫度高于30℃時，蘋果酸-乳酸發酵也將減弱。在實際應用中，蘋果酸-乳酸發酵的溫度多在18～20℃。
5. pH值
pH值作用主要表現在：①影響乳酸菌成活率，從而決定進入蘋果酸-乳酸發酵前遲滯期的長短；②影響乳酸菌的生長速率，從而影響蘋果酸-乳酸發酵速度；③影響果酒中乳酸菌的生長種類。蘋果酸-乳酸發酵在酸度較低的酒中很容易發生。通常需要進行MLF的酒的pH值為2.8～3.5之間，乳酸菌最適生長pH為4.2～4.5。當pH值為3.0或更低時，幾乎所有的乳酸菌都受到抑制，在pH值3.0～4.5之間，pH值越高，蘋果酸-乳酸發酵就越容易。pH也影響微生物的代謝，在pH3.2以下時許多MLB分解蘋果酸，在pH3.5時則進行糖的分解。在pH3.8時MLF的速率高于pH3.8以下時的速率，在pH3.2時比在pH3.8時慢10倍。有的菌株對酸有高的耐受性。在pH3.5以下的酒中，酒類酒球菌是優勢菌群，在較高的pH條件下乳桿菌和片球菌可以生存和生長。
6．有機酸含量
MLB通過3個不同的酶促途徑轉化蘋果酸為乳酸和CO2。一些MLB擁有蘋果酸-乳酸酶，使L-蘋果酸脫羧基直接產生L-乳酸，而不經歷游離的中間產物。一些MLB擁有蘋果酸酶，如干酪乳桿菌和糞腸球菌，可以轉化L-蘋果酸為丙酮酸，后者一部分還原為L-乳酸，使其在以蘋果酸為唯一碳源的培養基中生長。第3種途徑見于發酵乳桿菌，L-蘋果酸被蘋果酸脫氫酶還原為草酰乙酸，之后脫羧基形成丙酮酸，再還原為乳酸。一些研究表明，L-蘋果酸促進酒類酒球菌生物量的增加，在較低的pH，L-蘋果酸代謝速率很高，而碳水化合物代謝進行得非常慢。
在MLF過程中，酒類酒球菌在乙醇發酵后代謝檸檬酸和殘留的碳水化合物。酒類酒球菌不能在以檸檬酸為唯一碳源的培養基上生長，然而，在葡萄糖出現的情況下生長速率和生物量增加。在有葡萄糖時丙酮酸的代謝流向主要是2，3-丁二醇和乳酸的產生，而乙偶姻是檸檬酸代謝的主要產物。檸檬酸誘導生長增強，部分原因是它與葡萄糖共代謝時ATP產生增加。
酒石酸只有在氧條件下才被MLB代謝，這意味著只有將果酒暴露于空氣下才能代謝。琥珀酸在乙醇發酵過程中由酵母產生，不能被MLB代謝。醋酸是在糖和檸檬酸代謝中由細菌產生。葡萄糖酸鹽和丙酮酸或許被MLB經己糖-磷酸途徑代謝為乳酸、乙酸和CO2，由于丙酮酸結合SO2，所以MLB的生長導致SO2釋放，或許可以降低為阻止氧化和微生物腐敗所加入的SO2的量。
癸酸和月桂酸作為生長因子刺激蘋果酸-乳酸發酵，但濃度更高時這些酸對MLF有抑制作用。當培養基pH從6降低到3時，這些脂肪酸的毒性作用增加，表明未解離分子是其毒性形式，這些脂肪酸在膜脂中高度可溶，經被動擴散進入細胞。一小部分這些脂肪酸或許整合到細胞膜，修飾其成分和改變通透性。低濃度脂肪酸增加L-蘋果酸的通透性，因而促進L-蘋果酸降解。高癸酸(20mg/L)和月桂酸(5mg/L)濃度時，ATP酶的活性分別減少約5%和42%，因為長鏈脂肪酸脂溶性更高，毒性也更強。
7．釀造工藝
澄清過度會降低發酵醪中天然乳酸菌的菌群數，降低乳酸菌生長所需的營養物質含量，減少了自然啟動蘋-乳發酵的可能性。另外，采用熱浸漬方法釀造的果酒，較難觸發蘋-乳發酵。發酵容器(橡木桶、不銹鋼罐、罐的形狀等)、浸提出的單寧含量、外源添加單寧的含量、溶解氧的含量、營養物的補充以及延長酒腳接觸時間，都會影響乳酸菌的生長。果酒接觸氧氣后會促進雙乙酰的產生，因為氧氣會促進乙酰乳酸氧化成雙乙酰。在半好氧環境中雙乙酰的積累量是完全厭氧環境中雙乙酰含量的6倍。雙乙酰還原成3-羥基-2-丁酮的程度取決于酒的氧化還原電位，若電位較低，酒中雙乙酰則較少。蘋-乳發酵結束后，采用延遲分酒、酒腳陳釀工藝或過濾操作都會影響酒的感官品質。酵母酒腳會分解雙乙酰，Batonnage操作(攪桶，使酵母菌殘體與酒液增加接觸)會降低甚至消除黃油味。
8．酚類物質
有些酚類化合物會抑制乳酸菌的生存和生長，而另一些酚類化合物又易于觸發蘋-乳發酵。Knoll等評估了3種酚酸(咖啡酸、香豆酸、阿魏酸)在模擬酒液(pH3.8，酒精度12%)中對不同乳酸菌成活率、生長速率和活性的影響。當咖啡酸的濃度為50～100mg/L時，對乳酸菌的生長有積極作用，能夠促進蘋果酸的代謝分解。阿魏酸對乳酸菌的生長及代謝蘋果酸的負面影響與酒精發酵接種的酵母菌特性有關。對蘋-乳發酵抑制作用最強的是香豆酸，且抑制作用隨濃度增強而增強。關于酚酸抑制或促進乳酸菌生長的作用機理有待深入研究。另有實驗指出，在模擬酒液(pH3.5，酒精度13.3%)中優質花青素(濃度為250mg/L)能夠刺激乳酸菌的生長，而來自果梗和果籽的粗澀劣質單寧有可能抑制乳酸菌生長。
9．乙醛
乙醛具高揮發性，感官閾值為100～125mg/L。在低水平，乙醛有愉快的果香味，但過量時出現不良的風味，如綠色、草綠色或蘋果樣風味。加SO2可掩蓋其風味，但SO2和乙醛結合失去其抗菌作用和抗氧化作用。乙醛和酚類化合物結合產生了穩定的聚合色素，對SO2的漂白作用有耐受性，但它可能引起渾濁和沉淀。
游離乙醛對MLB的影響尚不清楚，因為低水平的乙醛(≤100mg/L)刺激異型發酵型奶源MLB(如腸膜明串珠菌)的生長，一般認為乙醛作為異型乳酸發酵的電子受體，使形成額外的能量，然而，高水平的乙醛(>100mg/L)抑制MLB的生長。酒球菌和乳桿菌可以代謝游離和SO2結合的乙醛，主要形成乙醇和乙酸。
10．其他微生物
酒類酒球菌生長使pH提高到一定的水平時，使其他MLB生長可能會促進MLF，但如果其他MLB競爭營養并產生細菌素則抑制MLF，用MLB生產發酵乳制品和發酵蔬菜時噬菌體引起的MLB裂解是一個重要的問題，但在果酒釀造中是否引起同樣問題尚不清楚，曾有在葡萄酒發酵過程中MLB感染噬菌體的報道。
11．通氣
通入空氣常常有利于乳酸菌的生長。飽和空氣的新果酒提前幾天出現蘋果酸-乳酸發酵，相反，如果用純氧飽和反而延遲，但不完全阻礙?？偟恼f來，對果酒發酵過程通風有利于進行蘋果酸-乳酸發酵。
12．酒腳
處于發酵罐底的酒腳(尤其是大型發酵罐)緊密壓實，不易活動，因此嚴重影響酵母、乳酸菌和營養物之間進行物質交換。這可解釋為什么大型發酵罐較難啟動蘋-乳發酵。然而，這一問題可以通過在乳酸菌接種數小時后對整個罐體加強攪拌作用來解決，保障順利啟動蘋-乳發酵。發酵過程中，建議每周對酒腳攪動一次，確保乳酸菌和營養物懸浮。
13．農藥殘留
農藥及殘留物會延滯或中止蘋-乳發酵，甚至阻礙發酵的啟動。農藥及其殘留物質對蘋-乳發酵存在重大負面影響。因此，控制農藥用量、注意原料衛生質量對保障蘋-乳發酵意義重大。
三、蘋果酸-乳酸發酵的作用
MLF對果酒的影響很多，但主要表現為降酸、提高細菌穩定性、風味的改善和改變酒色。
1．降酸
蘋果酸-乳酸發酵將氫離子固定在乳酸上可以使滴定酸度下降到0.03g/L(以酒石酸酸度計)，pH增加0.3，從而使果酒的酸度降低，改善果酒的口感。
2．提高細菌穩定性
經過MLF的葡萄酒比沒經過MLF的葡萄酒穩定得多。蘋果酸和酒石酸是果酒中的固定酸。與酒石酸相比，蘋果酸為生理代謝活躍物質，易被微生物分解利用，通常的化學降酸只能去除酒石酸，而果酒經過MLF可使蘋果酸分解，提高果酒中細菌的穩定性。另外蘋果酸-乳酸發酵發生時由于營養物質的消耗或細菌素的產生使其他微生物的生長受到抑制。蘋果酸-乳酸發酵發生的時間也很重要，如果發生在果酒裝瓶之前，就可預防其在瓶中的生長。乳酸菌在瓶中的生長或可引起果酒渾濁、CO2產生，產生多糖導致酒體變黏，或pH提高促使其他腐敗微生物生長等。
3．風味的改善
果酒經蘋果酸-乳酸發酵之后，不僅產生乳酸，也產生其他代謝產物，對果酒的風味產生影響。在有限通風條件下，酒類酒球菌傾向于產生乳酸和乙醇，欲產生更多乳酸則要求更多的通風。然而，其他乳酸菌在此條件下可能產生醋酸，醋酸本身有刺激性，所產生的醋酸的量非常重要，應避免超出感官檢測的閾值。乳酸菌產生的另一個重要的化合物是雙乙酰，雙乙酰有特征性的奶油風味。雙乙酰的形成取決于前體物質的出現，可由乙醛和乙酰CoA反應形成，或由丙酮酸和乙醛反應產生五碳的乙酰乳酸，后者進而再形成雙乙酰分子和一分子CO2。乳酸菌發酵過程中產生的2，3-丁二醇來自乙偶姻，具有淡淡的苦啤酒的風味，通常在檢測閾值以下。乳酸菌發酵過程中還產生乳酸乙酯、丙烯醛等，對果酒的風味產生影響。
在含氮豐富的果汁發酵時，酒中會出現奶酪的風味。賴氨酸是酵母的重要營養，但過量添加會導致出現所謂的鼠臭味。一些植物乳桿菌和短乳桿菌代謝酒石酸為醋酸，產生所謂的敗壞病。這些是果酒釀造中不希望看到的。
進行MLF的酒類酒球菌可以分解酒中的檸檬酸生成乙酸、雙乙酰及其衍生物(乙偶姻、2，3-丁二醇)等風味物質。其代謝活動也改變了果酒中的醛類、酯類、氨基酸、維生素等微量成分的濃度和含量，增加了風味的復雜性，對酒的風味有修飾作用。此外，MLF可以增加單寧縮合度和增加單寧膠體層，使酒的口感更為柔和。并且在MLF過程中，植物性味道減少，能使酒的水果風味更好地展現出來。
4．改變酒色
在MLF過程中，果酒總酸下降、pH上升，從而導致酒的色調由紫紅向藍色轉變。此外，酒類酒球菌利用了與SO2結合的物質如丙酮酸、α-酮戊二酸等，釋放出SO2，游離的SO2會與花色苷結合而降低果酒的色度。在有些情況下，經過MLF后，色度可下降30%左右，從而使酒顏色變得老熟。
四、蘋果酸-乳酸發酵的抑制
蘋果酸-乳酸發酵并不總是對改進果酒的品質有益處，有時即使用理想的乳酸菌發酵，也難免會產生一些不愉快的氣味。一般來說，如果希望獲得口味清爽、果香味濃、盡早上市的酒，則應防止這一發酵的進行。為此，可以采取以下抑制措施：保持酒的pH值在3.2以下；使酒精度達14%以上；低溫貯存；把總二氧化硫濃度調至50mg/L以上，盡早倒酒和澄清；減少果皮的浸漬時間；巴斯德殺菌和濾菌板過濾；添加化學抑制劑；添加細菌素，如乳酸鏈球菌素、植物乳桿菌素和片球菌素等；添加溶菌酶。
五、蘋果酸-乳酸發酵的促進
通過添加人工培養的乳酸菌或依靠野生乳酸菌來啟動蘋果酸-乳酸發酵。主發酵結束后，不能使大量酵母在酒液中存在太久，因為死酵母會發生自溶現象，往往給酒體帶來不良的風味。然而在后發酵階段，少量的酵母自溶對酒體是有益的，因為少量酵母自溶釋放出的營養物質可以促進蘋果酸-乳酸發酵細菌的增殖。如果在生產中欲進行蘋果酸-乳酸發酵，須注意以下要求：
① 倒酒的時間不要太早，使酒泥中存在的酵母自溶物質促進乳酸菌的生長繁殖。
② 倒酒時不要添加二氧化硫，因為二氧化硫會抑制乳酸菌的生長，倒酒后新鮮果酒中游離態二氧化硫的量不宜超過20mg/L。
③ 果酒的貯存溫度不宜低于10℃，低于10℃會對乳酸菌的生長和蘋果酸-乳酸發酵的進行有所抑制。
④ pH宜控制在3.6～3.8，低于pH3.5一般要采取誘發措施使蘋果酸-乳酸發酵啟動。
⑤ 因為蘋果酸-乳酸發酵在厭氧條件下進行，因此充分隔絕氧氣有利于蘋果酸-乳酸發酵的進行。
六、蘋果酸-乳酸發酵的消除
通過以下措施可徹底抑制蘋果酸-乳酸發酵：過濾除菌、加熱殺菌、使用防腐劑。
1．過濾除菌
過濾除菌后再進行無菌灌裝，可以徹底清除進行蘋果酸-乳酸發酵的可能。這種方法可以保證商品酒的貨架穩定性，并且對酒的感官質量不造成影響。過濾膜的標準孔徑不能大于0.45μm?？梢韵扔么譃V方法除去大部分沉淀物，再進行膜過濾或錯流過濾除去酵母和細菌。另外，過濾器后的所有下游設備包括輸送管道、灌裝設備和包裝材料都必須保證無菌狀態，產品的質量控制十分重要，一般從灌裝生產線上按批次取樣，用無菌膜過濾，將膜放在營養培養基上保溫培養，然后用肉眼檢查是否長出菌落。這些細菌對營養要求苛刻，可以選用添加20%果汁或番茄汁的MRS培養基，它們一般是嗜中溫菌，而且生長緩慢，在大約25℃溫度下需培養至少10天。
2．加熱殺菌
加熱殺菌可以有效防止果酒中的酵母重新發酵，該方法同樣適用于殺死蘋果酸-乳酸發酵細菌，高溫短時巴氏殺菌(82℃，15～25s)可以在酒的風味受影響較小的情況下有效地殺死細菌。與過濾除菌相似，殺菌后的整個下游系統(灌裝線、灌裝設備、酒瓶、瓶塞)也必須進行滅菌并保證無菌狀態，當然小規模的果酒釀酒廠可采用瓶內滅菌的方式，即灌裝后連瓶子一起進行低溫長時巴氏殺菌(63℃，30min)，但是因為包裝后進行殺菌所需的升溫時間和降溫時間均較長，所以會對果酒的風味有所影響。
3．使用防腐劑
經常用于限制蘋果酸-乳酸發酵的防腐劑為二氧化硫。一般情況下，總二氧化硫在100mg/L以上，或結合二氧化硫在50mg/L以上，或游離二氧化硫在10mg/L以上，就可抑制果酒中乳酸菌繁殖。