第三節 乳酸菌的使用
幾十年來，人們對MLF進行了大量的研究，但目前仍存在著一些需要解決的問題，發酵工程技術在MLF中的應用還只是處在一個開發和研究的階段，MLF還只能部分地進行。雖然通過基因工程技術選育出了蘋果酸乳酸菌，但菌株的遺傳穩定性、蘋果酸-乳酸酶基因和蘋果酸通透酶基因在工業果酒酵母菌中的表達及其安全性等問題還有待解決。目前，選育耐低pH、較高酒精度和SO2，且釀酒特性好的乳酸菌種的需求較為迫切，MLB的營養條件、MLF的發生與控制的研究還需加強。
一、自然蘋果酸-乳酸發酵的風險
自然進行的蘋果酸-乳酸發酵，無法控制、誘導或選擇參與發酵的乳酸菌，從而無法獲得可預測的結果，酒的質量將面臨極大的風險；接種人工篩選和優化的酒類酒球菌以及嚴格控制整個發酵過程是獲得良好的MLF結果的根本保證。
眾所周知，乳酸菌將果酒中的乳酸轉換成蘋果酸的同時，亦將產生一系列副產物。其中有些副產物是有益的，如乙酸乙酯和丁二酮等，它們使果酒香氣更加復雜，釀酒師通常會通過對蘋-乳發酵有效的控制適當獲得這類有益的副產物。但如果對蘋-乳發酵不加以控制或對發酵進程失控，不可避免地就會有一些無益的或有害的副產物產生，這是釀酒師所不愿意看到的。為了保證獲得盡可能完美的結果，應當盡量避免發生自然的、無控制的MLF。失控的、自然進行的乳酸菌的新陳代謝可能帶來的風險或缺點如下。
1．刺激的酸乳味
當酒精發酵后期發酵速度過于緩慢，或發酵意外停止時，果酒中會存在一定的殘糖，細菌首先會利用這些糖，將糖轉化成乙醇、醋酸和CO2，同時將一定量的酒石酸轉化成D-乳酸，給酒帶來較濃烈的酸乳味。
2．苦味
由于酒中甘油分解成丙烯醛，而丙烯醛與酒中的單寧結合，給予酒一種令人非常不愉快的“苦味”。
3．揮發性酚的產生
4-乙烯基酚、4-乙烯基愈創木酚和4-乙基酚等揮發性酚類會給酒帶來類似馬廄或馬汗的氣味。通常，揮發性酚是由足球菌屬和乳桿菌屬的細菌產生的。
4．某些化合物
有些乳酸菌在新陳代謝時，會將酒中的精氨酸轉化，形成瓜氨酸，而瓜氨酸是氨基甲酸乙酯的前體，氨基甲酸乙酯對人的健康是有害的。在歐洲，許多國家對此物質進行嚴格的檢測和限制。此外，某些特殊的氨基酸會產生脫羧反應，導致生成各類生物胺(如組胺、腐胺、尸胺等)，它們對人的健康均有害。
不良氣味和口感的產生，取決于在MLF過程中，何種乳酸菌起主導作用。當然，某些菌屬的乳酸菌，對蘋果酸-乳酸發酵的順利進行、果酒質量的改善、果酒微生物穩定等方面是有積極意義的。它們轉化了酒中的蘋果酸，同時產生了一些對酒有益的副產物，降低了酒的總酸，使酒的成分更均衡，并對酒的色素盡最大的保護。就目前研究和實踐所取得的成果而言，人工選擇并優化后接入酒中的酒類酒球菌正是其中最出色的一種。因此，人工接種優選乳酸菌進行MLF，是避免上述諸多不良副產物的出現，并有效控制和正確引導MLF的不二方法。人工優選的乳酸菌，會產生適量的乙酸乙酯、丁二酮等副產物，增加酒的香氣和復雜性。與此同時，增加了可感知的漿果品種香，減少了酒的生青味、粗糙的“澀感”和“苦味”。考慮到某些種屬的乳酸菌在繁殖時，會消耗一定的乙醛，導致SO2的濃度有所降低，因此，在MLF之后，通常建議分析SO2并決定是否適當補充SO2。某些種屬的乳酸菌，特指酒類酒球菌屬，會生成對提高酒質量有益的有機物，增加酒的“醇厚感”和后味，這是為什么人工篩選的乳酸菌均為酒類酒球菌屬的重要原因。
二、蘋果酸-乳酸發酵的誘導
1．自然誘導
提供適宜的環境條件，MLF可以自然發生。但是，自發的蘋果酸-乳酸發酵是難以預測的，由于酒精發酵后的有些果酒中可能還存在乳酸菌的噬菌體，它們可能延遲或抑制MLF，使得MLF在觸發上難以保證。這種延遲對果酒釀造者而言，是相當昂貴的，它增加了腐敗菌在進行繁殖的同時產生異香與異味，導致酒病害的可能性。溫暖的氣溫、很低的SO2、適宜的pH值，非常有利于微生物腐敗。
2．人工接種誘導
生產上常利用優良乳酸菌種經人工培養后添加到果酒中，以克服自然發酵不穩定、難控制等問題。現在人們已開始應用更為簡單的方法進行MLF，如可利用引子培養物(含乳酸菌的發酵劑)，不但可以迅速達到觸發MLF的數量級，而且在MLF過程中居于主導地位，有利于釀造優質果酒。目前，一些冷凍干菌種不用活化和擴培就可以直接加入到果酒中。根據不同的地域條件和原料品質選擇適宜的菌種進行MLF，成為酒廠釀制優質高檔佳釀的關鍵。
三、現代發酵工程技術在蘋果酸-乳酸發酵中的應用
由于MLF對發酵條件的要求比較復雜，生產上常常出現MLF發酵遲滯甚至接種失敗的現象。為此，釀酒者希望有快速、可行的方法啟動并完成MLF，近年來，現代發酵工程技術的進展，為革新MLF的工藝操作提供了新的思路。
1．固定化技術
固定化技術是20世紀60年代在相應學科發展的基礎上產生的一種新的生物技術。所謂固定化技術，是指利用化學或物理手段將游離的微生物細胞或酶，定位于限定的空間區域并使其保持活性，使之成為連續流動的生物反應器，并可反復使用的一種基本技術，包括固定化酶技術和固定化細胞技術。
微生物的固定化法主要有包埋法、吸附法、交聯法和微膠囊化4種方法。以前用于MLF的固定化技術只有包埋法和吸附法兩種。固定化的乳酸菌降解了30%的蘋果酸，使白葡萄酒的pH從3.15上升到了3.40，對蘋果酸的轉化率是游離乳酸菌細胞的2倍，且穩定性好，可持續達6個月。
與固定化細胞技術相比，固定化酶技術需要酶的分離，并且需要輔酶再生，因此該技術在生產上的應用受到很多限制。用商業的Saccharomyces cerevisiae菌株(Uvaferme 299)制成固定化生物催化劑，用于常溫(15～25℃)的干白葡萄酒的發酵，發酵產物具有低揮發酸、低甲醇和低乙醛含量等特性，該固定化細胞系統可穩定持續4個月，感官評價表明與游離細胞系統相比，葡萄酒風味品質有明顯改善。
2．膜生物反應器(membrane bioreactor，MBR)的應用
膜生物反應器技術是對固定化技術的發展，是通過凝膠膜、人工聚合膜或其他膜載體把酶/酶、酶/輔酶、酶/細胞或細胞器/酶等反應組元固定起來(也可以是游離態)進行生化反應。有人從酒明串珠菌8406中提取純化了MLE，并把游離的MLE和輔酶因子通過特制的polysulfone膜及有機玻璃反應板制成生物反應器進行MLF，結果表明，蘋果酸的分解率可達70%以上。
3．分子生物學
近年來，分子遺傳學手段已經應用到了葡萄酒微生物的育種領域。科學家等曾進行過不同乳酸菌Mle基因在釀酒酵母中的功能表達。有人克隆了酒類酒球菌(Oenococcus oeni)的MleA基因，在大腸桿菌中得到表達，其蛋白的分子量為60kD。Ansanay等使多拷貝的MleS基因在乙醇脫氫酶Ⅰ(ADHⅠ)啟動子控制下，在Saccharomyces cerevisiae中得到較高水平表達，其MLE活性是Lactococcus lactis的3倍，他們的研究使得Mle在酵母菌中的表達較前有較大幅度的提高，但含有Mle基因的酵母轉化子降解外源L-蘋果酸的效率仍局限在20%以下。釀酒酵母體內由于缺乏L-蘋果酸的轉運蛋白而引起蘋果酸鹽的轉運效率受到限制，是酵母轉化子降解外源L-蘋果酸效率不高的主要原因，將Lactococcus lactis的Mle基因和Saccharomyces pombe的蘋果酸通透酶基因(Mae1)在酵母中共表達，使L-蘋果酸的降解能力大幅度提高。將蘋果酸通透酶基因和MleS基因同時克隆到釀酒酵母中，這樣就解決了底物蘋果酸轉移到細胞內的問題。
構建可進行MLF的酵母工程菌，可免去依賴乳酸菌的MLF過程，使兩步發酵由酵母菌單獨完成，縮短釀造周期，避免細菌在MLF過程中產生不必要的代謝副產物，并可減少細菌引發果酒破敗的危害。這不僅可深化對果酒微生物降酸機制的了解，而且可以豐富和發展果酒釀造的工業微生物學理論，簡化果酒的釀造工藝，經濟有效地控制生物降酸過程。因此，對MLF相關酶及基因的深入研究，具有重要的理論意義和實際應用價值。但同樣也面臨著許多的問題，如蘋果酸-乳酸酶基因和蘋果酸通透酶基因在工業微生物酵母菌中的表達及其安全性，以及菌株的遺傳穩定性等問題還有待解決。
四、乳酸菌的接種量和接種時間
人工誘導蘋-乳發酵能夠更好地控制酒的香氣和口感，酒類酒球菌是最有效且最常用的商品乳酸菌。優良酒類酒球菌能夠有效降低其他類型乳酸菌的不良發酵對酒產生的負面影響。
誘發蘋-乳發酵乳酸菌的最低接種量為106CFU/mL，若接種量不足會嚴重影響蘋-乳發酵的啟動，延緩發酵進程。采用較高乳酸菌接種劑量能夠快速啟動蘋-乳發酵，加快發酵速率，但也會降低雙乙酰的生成量。
但是，潘海燕等認為過高的接種量可能會使蘋果酒在MLF后因乙酸含量過高而具有不好的口感。通過實驗，發現乳酸菌的接種量越高，發酵結束以后乙酸的濃度也就越高，在接種量從6%變化到10%的過程中，乙酸的濃度增加了近一倍，所以為了提高蘋果酒的品質要嚴格控制接種量。在乳酸發酵順利進行的情況下，采用較小的接種量有利于提高蘋果酒的風味。
乳酸菌的接種時間一般有如下3種選擇：與酵母同時接種；在酒精發酵期間接種；在酒精發酵完成后接種。
不同時期接種各有特點，在酒精發酵后接種，由于酵母菌體自溶產生了較多的適合乳酸菌生長的營養物，由乳酸菌引起的糖代謝，繼而產生大量的醋酸和D-乳酸的危險性可降至最低限度，同時也避免了潛在的酵母生長的拮抗作用。另外，釀酒期趨于結束，對人力物力的需求高峰已過，此時接種乳酸菌較為方便。與酵母同時接種或在酒精發酵期間接種可以使乳酸菌利用較多的營養物質，由于此時酒精濃度較低，為細胞生長提供了更好的機會，接種后，由于乳酸菌適應了不斷增加的酒精濃度，使細胞死亡率降至最低，它可以使蘋果酸-乳酸發酵在酒精發酵結束之前或剛剛結束時迅速完成，這樣可以有效地縮短發酵周期，減少酒的處理過程，尤其是用橡木桶發酵的葡萄酒。如果SO2的添加量很小，乳酸菌可以在果實破碎時添加或與酵母同時添加。對于含SO2的果酒，建議在酒精發酵之后或發酵期間接入乳酸菌，以使游離SO2化合。因此，接種時間的選擇應根據酒的種類、果汁的組成、酵母菌株、作業條件等靈活掌握。
五、蘋果酸-乳酸發酵過程的檢查與控制
1．接種前檢查
pH，3.2～3.5；溫度，18～20℃；SO2濃度，無游離SO2或微量，總SO220～40mg/L；酒精濃度，<14%(體積分數)；營養狀況，與皮渣接觸時間、漿果品種有關；自然菌群，有用的和有害的；MLF的潛力，難易程度。
2．每隔2～4天檢查
檢查并保持溫度18～20℃；分析L-蘋果酸含量(每天下降0.1～0.2g/L為最好)；顯微鏡檢查，包括細胞數量的增加及菌鏈的形狀；感官鑒定。
3. MLF結束
L-蘋果酸含量<0.1g/L；自然發酵4～12周；人工發酵2～8周。
4．無活性的MLF
檢查攪拌罐；重新檢查所有的酒參數；確定活菌的數量(選擇性培養基/熒光顯微技術)，檢查其他微生物的活性、細菌與酵母的拮抗作用；農藥殘存量；用不同菌種的新鮮培養液重新接種。
六、蘋果酸-乳酸發酵的檢測
蘋果酸-乳酸發酵的特點是滴定酸和pH的變化，但是以上變化的程度不一樣，并且可能被酒中其他反應所掩蓋，這是因為其他反應會引起酸度和pH變化。但是乳酸含量的變化也不能說明蘋果酸-乳酸發酵的進行，因為酵母和細菌利用其他碳源也可能產生乳酸。能判斷蘋果酸-乳酸發酵是否進行的最好方法是檢測果酒中蘋果酸的變化。
檢測蘋果酸含量的需用方法有紙色譜法、酶分析法和液相色譜分析法。液相色譜分析法所需的設備十分昂貴，一般僅在大型的理化分析檢測中心和果酒廠才有，而紙色譜法和酶分析法在大多數果酒廠均能實現。
1．紙色譜法
紙色譜法是一種以濾紙為支持物的色譜分析方法，主要利用分配原理。濾紙吸附的吸附水是固定相，展開劑為流動相，濾紙只起到支持固定相的作用，流動相促進組分向前移動，固定相阻礙了它的前進，所以各組分以小于溶劑移動的速度向前移動，使不同的組分分開。各組分具有不同的分配系數K，K大的組分移動速度慢，K小的組分移動速度快。
定性依據：比移值Rf表示樣品組分在濾紙上的位置，也表示組分在流動相和固定相中運動的情況。
紙色譜法原理：將果酒以小圓點的形式點樣于濾紙上，經展開、顯色后，根據比移值與標準比較定性、定量。酒石酸移動速度最慢，離點樣點最近，酒石酸Rf在0.26～0.30；乳酸和琥珀酸速度最快，被推動到濾紙的最頂端；乳酸和琥珀酸Rf在0.69～0.76；蘋果酸移動的速度處于兩者之間，蘋果酸Rf在0.52～0.56之間。
操作方法：濾紙為長方形(20cm×30cm)，沿長的一邊距下邊緣2.5cm處點果酒樣，兩點之間間隔為2.5cm。每一個點用微量吸管點4次樣，兩次點樣之間要風干，點樣總體積約10μL(點越小分辨率越高)。然后用3個訂書釘沿短邊卷起形成一圓柱筒，注意不要接觸紙邊或使邊緣重疊，用帶螺旋蓋的約4L的大口缸做色譜缸。在分液漏斗中裝10mL水、100mL正丁醇、10.7mL濃甲酸和15mL含量為10g/L的溴甲酚綠溶液，在通風櫥或通風良好的防火區域搖勻混合，幾分鐘后將下相放出棄之不用，將上相70mL放入色譜缸內，將濾紙的點樣邊浸入溶劑，蓋好蓋，展開時間為6h左右，即可得到最佳結果，展開時間延長至過夜也是安全的，即使溶劑達到上邊緣。或者約3h后取出濾紙，這時圓柱紙筒只用了10cm，取出黃色濾紙后，將其放在通風良好的地方風干，直至甲酸完全揮發，剩下為藍綠色背景上帶黃色的各種酸的斑點。每次紙色譜分離后，將溶劑中水相除去可重復使用。當需要在3h內得到結果時應采用酶分析法。
2．酶分析法
應用酶法檢測蘋果酸-乳酸發酵過程中L-蘋果酸的含量，可有效實現蘋果酸-乳酸發酵過程的工藝控制。該方法特異性好，靈敏度高，簡便快速，定量準確，能夠滿足實際檢測的需要。經實際驗證測定一個樣品僅需20min左右，能廣泛地應用于蘋果酸-乳酸發酵過程中蘋果酸的分析測定，對于釀酒企業監控和掌握蘋果酸-乳酸發酵進程具有重要的指導作用。
(1)原理 蘋果酸存在于果汁和果酒當中，可以在蘋果酸脫氫酶(MDH)的催化作用下，被煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)氧化生成草酰乙酸。在這個過程中生成的NADH，可通過紫外分光光度儀在波長340nm條件下測定其吸光度，以計算其含量，并最終得出樣品中L-蘋果酸的濃度。但是這個轉化過程可逆，因此有必要消耗掉生成的草酰乙酸，使反應進行徹底。而草酰乙酸可以與L-谷氨酸在谷草轉氨酶(GOT)催化下反應，在此過程中，草酰乙酸被不可逆地轉化成L-天冬氨酸，因而L-蘋果酸可以與最終生成的NADH形成穩定的對應關系，即可以通過測定生成的NADH含量來推算樣品中L-蘋果酸的含量。
(2)測定方法 在20～25℃條件下，選取1cm石英比色皿，按順序依次加入1000μL緩沖液、200μL NAD工作液、1000μL蒸餾水、10μL GOT工作液、100μL試樣(對照是加100μL蒸餾水)。將加好試劑的比色皿輕輕混勻，靜置3min后讀取吸光度值A1，再加入10μL MDH工作液，混勻后靜置10min，讀取吸光度值A2。
(3)結果計算 計算空白、標準品和待測樣品的凈吸光度AN，AN＝A2－A1；通過凈吸光度和實測吸光度，計算各樣品的吸光度修正值Ac，Ac＝樣品AN－空白AN。L-蘋果酸濃度計算公式：
CL-蘋果酸(g/L)＝0.4725Ac×稀釋倍數
運用本方法測定蘋果酸時，為保證結果的準確性，一般需要進行如下處理：樣品測定前進行適當的稀釋，以確保此時的蘋果酸濃度小于0.4g/L。對于未經稀釋的紅酒或顏色比較重的果酒，需要進行脫色處理。方法如下：取5mL樣品，加入0.1g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，混勻震蕩約1min，然后用0.45μm濾膜過濾。
在蘋果酸-乳酸發酵結束時，立即分離轉罐，同時進行SO2(50～80mg/L)處理。
如果已經有正在進行蘋果酸-乳酸發酵的果酒，可用“串罐”的方式使需要的酒進行該發酵。如果要在發酵前加入乳酸菌，應選用植物乳桿菌的菌系；而在酒精發酵結束后添加乳酸菌，則應選用酒類酒球菌的菌系。在使用商品活性干乳酸菌時，應按說明書的要求操作。對于不需要進行蘋果酸-乳酸發酵的果酒，應采取相應措施，防止微生物的活動。