第二節　乳的熱穩定性及其影響因素

已經有很多實驗證明，盡管牛乳的熱穩定性與乳中存在的各種痕量的鹽有關，但并不能說熱穩定性與任何已知的要素有關。大量混合的牛乳的化學組成基本相似，但熱穩定性卻極其復雜，沒有一個因素能對其有明顯的控制。由一頭牛擠出的牛奶雖然每天的組成和熱穩定性可能都有所變化，但它的復雜性低于混合牛乳。

為酪蛋白磷酸鈣溶液或牛奶提供穩定性的主要因素毫無疑問是水合程度和離子所帶的表面凈電荷。但這些因素受到多種二級因素的影響，所以不能像其他理想膠體一樣給出簡單直接的解釋。牛奶是一種很復雜的混合物，含有許多有機和無機成分，不能忽略任何一個因素去討論牛奶的穩定性。但我們可以選擇一些對穩定性或不穩定性最有影響的因素進行討論。如：溶液中的組分、鈣、鎂離子、磷酸鹽離子和可溶性有機磷酸鹽、檸檬酸鹽離子、氯離子或氯化鈉、乳糖、氫離子（pH值）、無機磷酸鈣、α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、γ-酪蛋白、與酪蛋白發生反應的已熱變性的β-乳球蛋白，它們已成為膠束的一部分。

以上所提及的許多組分只有在它們相對其他組分處于最佳濃度時才能促進穩定性。同時各因素的相對重要性還可能依賴于凝固發生的類型（如酶凝固、熱凝固）及發生凝固時的環境（如發生在不同pH值水平的酶凝固）。

一、乳蛋白質對熱穩定性的影響

（一）酪蛋白對熱穩定性的影響

將不同牛所產的牛乳根據熱穩定性的不同進行分類，分為A類（有最大和最小熱穩定性）和B類（沒有最小熱穩定性）。加拿大的乳中有2/3呈A型，澳大利亞、愛爾蘭、蘇格蘭、荷蘭、新西蘭的乳中絕大多數是A型。通過添加κ-酪蛋白和β-乳球蛋白可以分別使A型變為B型或B型變為A型。而添加α-酪蛋白或β-酪蛋白卻不能改變牛奶的熱穩定性類型。添加κ-酪蛋白不能影響牛奶在90℃加熱10min時的熱穩定性和pH值的關系。研究表明，熱變性的β-乳球蛋白和κ-酪蛋白之間的反應是影響大多數牛奶的綜合熱穩定性和pH值關系的主要因素。但是關于β-乳球蛋白或κ-酪蛋白的含量與熱穩定性-pH關系圖之間的直接關系還沒有建立。Tessier等人（1964）的研究表明酪蛋白磷酸鈣膠束的表面組成是必須考慮的因素。向A型牛奶（在熱穩定性-pH曲線上有最大值和最小值）添加κ-酪蛋白可以降低或徹底消除最小值。由于加入κ-酪蛋白并不能破壞酪蛋白磷酸鈣膠束，所以可以得出結論，表面酪蛋白影響熱穩定性-pH曲線；而B型牛奶（在熱穩定性-pH曲線上沒有最小值）的膠束表面有過剩的酪蛋白。根據這個推斷，用NaCl處理B型牛奶，去除其表面的κ-酪蛋白可以使其轉變為A型牛奶。同理，添加β-乳球蛋白可以使A型牛奶轉變為B型。因此，熱穩定性-pH的曲線是由κ-酪蛋白和β-乳球蛋白的比例決定的。可以推測當牛奶加熱時，變性的β-乳球蛋白與自身、可溶性的酪蛋白和暴露在膠束表面的酪蛋白發生反應。因此，這些成分的比例影響了熱穩定性-pH曲線，同時那些影響變性的β-乳球蛋白與其他非酪蛋白分子發生分子反應的因素也會影響這條曲線，如加熱的速度和溫度。盡管當牛奶加熱至140℃時，充足的表面κ-酪蛋白使牛乳表現為B型，但在90℃預熱可能促進β-乳球蛋白和膠束表面的κ-酪蛋白的復合反應，這樣就保證了牛奶表現為A型。在某一特定的牛奶中酸性酪蛋白中κ-酪蛋白含量與膠束表面的κ-酪蛋白的數量（從熱穩定性-pH曲線上得出）沒有一定的關系。選用κ-酪蛋白含量高的膠束比低κ-酪蛋白含量的膠束能提供更多的表面κ-酪蛋白，也就是說更可能成為B型。這兩種膠束主要不同在于非有機磷酸鈣含量不同，這可能也影響了它們的表面性質。Fox和Hearn通過凝乳酶水解κ-酪蛋白的方法證實了κ-酪蛋白在pH≥6.9時對乳的熱穩定性有重要影響。

在乳濃縮前添加κ-酪蛋白可在整個pH值范圍內提高濃縮乳的熱穩定性，在脫脂乳中添加α_s2-酪蛋白，不影響最大穩定性而減弱了pH≥6.9時的乳穩定性。由添加α_s1-酪蛋白、β-酪蛋白而增加的合成膠束的熱穩定性隨pH值的增加而增加，據此可知B型乳的熱穩定性不僅依賴于κ-酪蛋白與β-乳球蛋白的比例，也和α_s1-酪蛋白、β-酪蛋白間的比例關系密切，若去除β-酪蛋白則乳表現為A型乳。

Singh和Fox（1987）認為β-乳球蛋白含量大于0.8%的情況下，加熱無酪蛋白膠束血清蛋白分散液（SPFCM）形成的凝固物或主要包括α_s1-酪蛋白、α_s2-酪蛋白或β-酪蛋白和相對很少的κ-酪蛋白的凝膠。酪蛋白膠束的穩定性主要是由κ-酪蛋白外伸的C-末端的位阻效應形成的，這些末端也賦予了膠束一個較高的表面電荷（-20mV）。從酪蛋白膠束中釋放出膠束態酪蛋白-β-乳球蛋白復合物可能削弱了κ-酪蛋白的外伸的C-末端的位阻效應帶來的穩定作用（這可能是主要的膠束穩定因素），顯著誘導了在Ca^2＋存在下無酪蛋白的膠束的聚集；膠束的Zeta電位也可能由于去除了κ-酪蛋白而降低。

陰離子和陽離子洗滌劑對于熱穩定性和凝乳酶凝固方面的作用顯然表明表面電荷對于膠束的穩定性有重要的意義。十二烷基磺酸鈉（SDS）對于熱穩定性的作用與β-乳球蛋白類似，這是由于SDS增加了膠束的凈負電荷；因此Shalabi和Fox認為β-乳球蛋白像SDS一樣是通過增加膠束的凈負電荷而增加了酪蛋白的穩定性。圖2-14顯示增加β-乳球蛋白的數量就增加了pH6.7時酪蛋白膠束的水化程度，而可能使體系穩定。如果增加表面電荷和水化程度的假設成立，則膠束的穩定假設也可以成立。β-乳球蛋白-κ-酪蛋白復合物對酪蛋白膠束的穩定作用依賴于溫度、pH值、Ca^2＋濃度。但在一定的pH值范圍內，這種復合物使酪蛋白膠束不穩定，因為當pH≥6.9時，它促進了膠束表面的酪蛋白的釋放，因此降低了膠束的電荷、水化程度和穩定性。

1.總蛋白濃度的影響

Andrew等（1999）研究了蛋白質濃度改變對單一乳清蛋白變性速率的影響。通過超濾將脫脂牛奶中總蛋白的量增加到兩倍，向脫脂牛奶中額外添加超濾液使蛋白質濃度減小到四分之一。以pH4.6時溶解性損失來測定總乳清蛋白變性速率，結果發現，當總蛋白濃度增加時，變性速率增加；總蛋白濃度下降時，變性速率下降。80℃加熱時，免疫球蛋白迅速變性，濃度對變性速率的影響不能測定。其他三種主要乳清蛋白質組分（血清白蛋白/乳鐵蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白）的變性速率隨總蛋白濃度增加而增加。以前的研究表明，乳清蛋白的變性敏感性為：免疫球蛋白＞血清白蛋白/乳鐵蛋白＞β-乳球蛋白＞α-乳白蛋白。

2.酪蛋白濃度的影響

Andrew（1999）將脫脂牛奶酸濾后重新調整pH值至6.7，然后再加回到脫脂牛奶中，這樣降低了酪蛋白的濃度而乳清蛋白濃度不變。在進一步的實驗中，離心脫脂牛奶獲得酪蛋白，然后又加回到脫脂牛奶中，這樣增加酪蛋白的濃度而乳清蛋白濃度不變。實驗表明隨著酪蛋白的濃度在脫脂牛奶中的增加，總乳清蛋白變性速率增加。隨著酪蛋白濃度加到大約脫脂牛奶水平的三分之一，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的起始變性速率很快。在這個濃度以上，變性速率增加很少。同樣，將脫脂牛奶中酪蛋白膠束的濃度翻倍，而保持乳清蛋白濃度不變，β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的變性速率只有少量增加。乳清蛋白的變性水平不受酪蛋白膠束濃度增加的影響。但當酪蛋白的濃度降至小于脫脂牛奶的三分之一后，乳清蛋白變性的速率顯著下降。

（二）乳清蛋白（特別是β-乳球蛋白）對熱穩定性的影響

單一乳清蛋白的變性速率隨總蛋白濃度的增加而增加，并與乳清蛋白的濃度有較小的相關。乳清蛋白主要對乳熱穩定性的pH值依賴關系產生影響。將β-乳球蛋白添加于去乳清蛋白的酪蛋白膠體中，若添加量＜0.6g/L對熱穩定性無影響，若添加量達0.6～3.6g/L、則pH6.5～6.7時增加穩定性，在強堿性區域穩定性下降。Rose（1962）的研究表明，熱變性的β-乳球蛋白和κ-酪蛋白間通過二硫鍵作用，從而影響乳熱穩定性的pH值依賴關系。Fox和Hearn發現α-乳白蛋白對乳熱穩定性的影響和β-乳球蛋白相似。血清白蛋白、溶菌酶使乳熱穩定性下降，研究表明，這種對熱穩定性的破壞作用也有二硫鍵形成的參與。濃縮乳熱穩定性隨著乳清蛋白的添加而下降，濃縮乳熱穩定性和pH值間的曲線形狀沒有變化。

Rose（1962）通過實驗發現，最大和最小的熱穩定性都與β-乳球蛋白的含量顯著相關（相關系數分別為0.50和-0.52）。非有機成分及其比例與最大熱穩定性并不相關。實驗結果表明變性的β-乳球蛋白-酪蛋白混合物（或κ-酪蛋白）是熱敏性的組分。

已有大量研究證實，熱變性的β-乳球蛋白和κ-酪蛋白之間的反應是影響大多數牛奶的綜合熱穩定性和pH值關系的主要因素。但這些組成對熱穩定性影響的定量關系尚未確定。只能推測當牛奶加熱時，變性的β-乳球蛋白與自身、可溶性的酪蛋白和暴露在膠束表面的酪蛋白發生反應，這些成分的比例影響熱穩定性-pH曲線。同時影響β-乳球蛋白與其他分子反應的其他因素也影響乳的熱穩定性。

Singh和Fox（1987）認為β-乳球蛋白在加熱的牛奶中扮演兩個不同的角色：它和酪蛋白的聚合防止了酪蛋白膠束在pH6.5～6.7的熱致沉淀；而當pH＞6.9時，它促進了膠束態酪蛋白的解離而降低了水化程度和可能的Zeta電位，因此使酪蛋白膠束不穩定。

Andrew等人（1999）通過加入冷凍干燥的乳清蛋白使脫脂牛奶中乳清蛋白濃度增加到原來的2.5倍。隨著脫脂牛奶中乳清蛋白濃度增加，總乳清蛋白變性的相對速率也增加。80℃加熱時，在所有乳清蛋白濃度下，免疫球蛋白都快速變性，因此不能測定它們變性速率的增加。但血清白蛋白/乳鐵蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的變性速率都隨乳清蛋白濃度增加而增加。

Tan-Kintia和Fox（1999）研究了乳清蛋白對預熱過的牛奶熱穩定性的影響，圖2-15的結果顯示在pH6.6或pH7.0，90℃預熱牛奶10min，將使牛奶的HCT-pH曲線發生漂移，在120℃、125℃或130℃測試熱穩定性時，發現HCT的最大值和最小值都下降了。升高測試溫度則不穩定影響降低，在40℃時達到一個很小值。在pH7.0預熱比在pH6.6預熱時HCT的最大值向更低的pH值漂移。

相反，對于去酪蛋白膠束血清分散液（SPFCM）而言，在130℃或140℃預熱都有穩定的作用。對于綜合的牛奶樣品（SPFCM中含有5mmol/L尿素、130mmol/L乳糖和0.35%β-乳球蛋白），如果在預熱過程中不含β-乳球蛋白則預熱有穩定的作用，若含有β-乳球蛋白則有一個不穩定的作用，這個效果在130℃測試時更明顯。當用半乳糖和葡萄糖替代乳糖時，HCT的最小值消失；但若有β-乳球蛋白存在，情況就不是這樣的。因此預熱造成的不穩定現象是由于β-乳球蛋白產生的（也許還有其他乳清蛋白）。

（三）酪蛋白和乳清蛋白相互作用對熱穩定性的影響

我們已經知道，熱變性的β-乳球蛋白和κ-酪蛋白之間的反應是影響大多數牛奶綜合熱穩定性和pH值關系的主要因素，但具體關系尚未明確。

Singh和Fox（1987）的研究表明，在90℃加熱含有β-乳球蛋白的酪蛋白膠束體系10min，當pH＜6.9時，β-乳球蛋白和酪蛋白膠束通過巰基-二硫鍵反應形成復合物，超速離心時形成共沉淀。這種復合物可以防止酪蛋白膠束在加熱時解離。但當pH≥6.9時，β-乳球蛋白和酪蛋白的復合物在加熱時解離，增加了κ-酪蛋白膠束的釋放。在pH7.3時高濃度的β-乳球蛋白（含量≥0.8%）促進了κ-酪蛋白膠束的解離而降低了聚集。這表明α_s1-酪蛋白、α_s2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白以相同的程度從血清蛋白中的游離酪蛋白膠束中解離，但β-乳球蛋白的存在特別增加了pH≥6.9時κ-酪蛋白的解離。pH6.7、β-乳球蛋白存在的情況下加熱酪蛋白膠束可微微增加膠束的水化，而在pH7.3時β-乳球蛋白卻降低了酪蛋白膠束的水化。β-乳球蛋白和κ-酪蛋白形成的復合物可以在pH6.5～6.7的范圍內穩定膠束，這可能是通過增加膠束的電荷或水化程度或防止κ-酪蛋白的解離來實現的。

實驗結果表明90℃的加熱處理導致了一些結構上的變化，在pH＜6.9時使β-乳球蛋白和κ-酪蛋白發生聚集。Sawyer提議β-乳球蛋白和κ-酪蛋白之間的反應有巰基-二硫鍵相互反應參與，但沒有共價鍵（如疏水相互作用）參與。β-乳球蛋白在低溫下以二聚體形式存在，30℃時解離為單體；55℃時開始展開，增加了—SH基團的活性。當pH＞6.8時β-乳球蛋白的—SH基團活性也顯著增加，這主要是因為N、R構象的轉換，所以β-乳球蛋白和κ-酪蛋白間通過二硫鍵結合的復合物的形成在高pH值下被加強了。圖2-16表明了在pH6.7和pH7.3時酪蛋白膠束和β-乳球蛋白間的巰基-二硫鍵的反應。

通過12%TCA不溶物的NANA（N-乙酰神經氨酸）分析表明β-乳球蛋白和酪蛋白的反應防止了酪蛋白膠束的解離，見圖2-17。但在較高pH值下它促進了酪蛋白從膠束中解離。這表明這種復合物在加熱情況下形成，在高pH值（pH≥6.9）時從膠束中解離，并增加了pH≥6.9時膠束態的酪蛋白解離。

β-乳球蛋白在pH6.5～6.7時對酪蛋白膠束的穩定作用還不甚清楚，以下是一些機制的推測：①β-乳球蛋白和酪蛋白的聚合可以增加膠束的電荷和水化程度，使體系穩定，圖2-18的結果顯示β-乳球蛋白的電荷是一種重要的穩定性因素；②β-乳球蛋白結合了Ca^2＋可能降低了血清中Ca^2＋的濃度而減少了熱致的磷酸鈣沉淀，Singh和Fox（1987）的研究并不支持此觀點；③防止了κ-酪蛋白從膠束中解離，見圖2-19，這是β-乳球蛋白在pH6.7時穩定作用的主要影響因素，β-乳球蛋白通過增加凈負電荷而增加了酪蛋白的穩定性。

β-乳球蛋白-κ-酪蛋白復合物對酪蛋白膠束的穩定作用依賴于溫度、pH值、Ca^2＋濃度。但在一定的pH值范圍內，這種復合物使酪蛋白膠束不穩定，因為當pH≥6.9時，它促進了膠束的酪蛋白的釋放，因此降低了膠束的電荷、水化程度和穩定性。

（四）氨基酸組成對蛋白質熱穩定性的影響

蛋白質側鏈氨基酸很大程度影響蛋白質的穩定性。17種嗜熱蛋白質含有芳香物質形成的串，而嗜溫蛋白質則不含這些物質。芳香族物質尺寸很小，而且大量集中在嗜熱蛋白質表面，靠近嗜熱酶的功能位點，形成的區域結構更加堅硬。額外添加到嗜溫蛋白質的芳香族物質更容易變異成為Leu、Ser或Ile。

對12個熱敏感蛋白質和32個熱穩定蛋白質研究表明，二肽組成影響蛋白質的熱穩定性。嗜熱和嗜溫蛋白質表面具有相似的疏水性、緊密性、聚合性、極性和非極性，主鏈和側鏈的氫鍵也相同。大多數嗜熱蛋白質結合金屬較多，也有更多的側鏈相連的氫鍵，在氨基酸組成方面具有更多比例的Arg和Tyr，而Cys和Ser較少。嗜熱蛋白質的α螺旋組分比例較高，而且其含的Pro較嗜溫蛋白質的低很多。

N-ε-甲基賴氨酸是谷氨酸脫氫酶熱穩定性的物質基礎。Bacillus macerans和Bacillus amyloliquefaciens的（1，3-1，4）-β-葡聚糖酶的從Pro6到氨基酸16（或17）的N-末端環區域對它的特性有重要影響，并能影響Ca^2＋對蛋白質熱穩定性的作用。

（五）自由能對蛋白質熱穩定性的影響

耐高溫的蛋白質具有更大的最大穩定性自由能，自由能每增加0.008kJ/mol蛋白質的耐溫度能力提高1℃。用二硫鍵強化鹽烷烴脫鹵化酶（Haloalkane dehalogenase，DhlA）可變區域產生的變異體可以提高蛋白質的穩定性，DhlA包含兩個區域：α/β-水解酶主要折疊區域和由5個α螺旋組成的cap區域。變異體的二硫鍵連接了可變區域的201位和主區域的16位，變性溫度由DhlA的47.5℃升高到52.5℃，而自由活化能降低0.43kcal/mol（1cal=4.18J，下同）。

（六）結構剛性和彈性對蛋白質熱穩定性的影響

蛋白質熱穩定性提高會引起牛乳多肽鏈的彈性下降，蛋白質發揮功能時需要足夠的彈性和剛性，但最適溫度越高、穩定性越高，結構剛性越強。葡糖淀粉酶單一Cys變異體N20C，A27C，T72C和A471C；雙Cys變異體N20C/A27C和T72C/A471C，50℃下N20C和A27C活性降低，而N20C/A27C和T72C/A471C與原來的酶活性相似。N20C/A27C熱穩定性提高，65℃時自由活化能增加1.5kJ/mol，而A27C的耐熱性質有輕微增加，N20C下降。pH4.5時T72C/A471C熱穩定性不變。20位和27位之間的二硫鍵連接了C-末端的螺旋結構，該區域對該酶耐熱性非常重要。

二、乳pH值的影響

（一）pH值對熱穩定性的影響

pH值是影響牛奶熱穩定性的最重要的單一影響因素。所有大批量的牛奶和大部分單一個體牛奶都在pH6.7有最大熱凝固時間，在pH6.9有最短熱凝固時間。曲線形狀受很多因素影響，其中比較重要的包括：乳清蛋白、其他熱變性蛋白、κ-酪蛋白、膠態磷酸鈣、可溶性鈣和磷酸鹽、清潔劑、分析條件（溫度和攪拌作用）、尿素、預熱處理、乙醛、濃縮或稀釋。140℃時大批量牛奶在最大熱穩定性pH值下熱凝固時間通常為20～30min。在如此高溫下在這段相對較長的時間內，發生了一些熱致變化。盡管這些變化最終導致了凝固，但相關研究很少。

Fox（1964）認為牛奶在凝固時pH值降至5.5～6.0，這種熱凝固溫度和pH值變化間的關系說明熱致凝固是一種酸性凝固。pH值降低過程中發生的三個主要反應包括：產生有機酸，主要是從乳糖中產生的甲酸；伴隨三價磷酸根釋放出H^＋，一價、二價磷酸鈣預沉淀；有機磷酸鹽（酪蛋白磷酸鹽）水解，釋放出H^＋導致磷酸鈣沉淀。

這些反應分別對pH值下降有50%、20%和30%的貢獻。普通牛奶中pH值下降的幅度是無乳糖牛奶的兩倍，其Q₁₀約為2，可溶性鹽濃度不能顯著影響Q₁₀，但頂空氣體組成會有顯著影響（乳糖分解為酸需要氧氣）。

Zeta電位和水合作用都隨著pH值降低而降低了。乳清蛋白和可溶性磷酸鈣改變了HCT和HCT-pH曲線的形狀。在常規的加熱牛奶中κ-酪蛋白的水解和去磷酸化及酪蛋白的水解都起著重要的作用。但當pH值保持接近起始pH值，則其顯著性可以忽略。

牛乳的pH值的微小變化都會顯著影響生鮮牛乳的熱穩定性。Dyson Rose曾比較不同牛所產牛乳的pH值對熱穩定性的影響，結果如圖2-20所示。結果表明，不同牛所產牛乳的熱穩定性受pH值影響不同，但在pH6.6～6.7時都表現出最大的熱穩定性，在pH6.7～6.9表現出最小的熱穩定性。進一步增加pH值可以使熱穩定性達到一個很高值。這種pH值高敏感性的牛奶在哺乳期內都存在，并且在其他牛奶樣品中也有同樣情況。從大批量的牛奶中采集的樣品與2號樣品的結果相似。1號樣品在整個哺乳期內曲線形狀很一致，但達到最大值的點不同。

從pH6.4～7.0的過程中，牛奶的熱穩定性經歷一個最大值和一個最小值。Rose（1962）發現當加入一些磷酸鹽時，最大值的位置微微向酸性方向偏移；若加入一些鈣，則微微向堿性方向偏移。但是這些離子的少量加入（約3mmol/L），只輕微地影響了可達到的最大熱穩定性。

濃縮乳在pH6.4～6.6有最大熱穩定性，pH＞6.8時穩定性差，總的來說濃縮乳的穩定性要明顯差于原料乳。

Fox（1964）在一個試圖測定被加熱的牛奶樣品在加熱一段時間后的確切pH值的實驗中，將樣品在140℃加熱0～20min，然后冷卻到90℃保溫10min，記錄pH值。這個過程以10℃的間隔降至20℃，在每個溫度下保溫10min。牛奶的pH值在60～90℃時與溫度保持近似的線性，見圖2-21，但進一步冷卻只導致pH值很微小的額外增加。這條曲線外推至140℃表明在140℃的凝固點（約20min）時pH值約為4.9。

在這些曲線上有兩個點可以由現有的數據證實，它們吻合得很好：在0℃保溫樣品的曲線外推至140℃時pH值為5.7；樣品在20℃凝固點測定的pH值為5.8。

考慮到在140℃下可以很快達到低pH值，則140℃時的熱凝固時間相對較長。Fox（1964）將原料奶的pH值預調至5.1～5.9，然后緩慢加熱，則凝固在相對較低的溫度下就可以發生。將凝固點pH值對凝結溫度作圖，如圖2-22所示。一個樣品預調至pH5.5（這個pH值通過磷酸鈣沉淀實現），在66℃左右發生凝固。對樣品的熱穩定性測試可知，當樣品通過沉淀磷酸鈣快速達到上述pH值，在140℃可以穩定20min，其中有一系列不穩定的變化發生。

Singh和Fox（1985）把pH6.6、pH6.8、pH7.0、pH7.2的牛奶在140℃預熱1min后發現HCT/pH曲線向酸性方向漂移，但沒有顯著影響最大穩定性。當pH＜6.9時加熱牛奶，乳清蛋白（包括β-乳球蛋白和α-乳白蛋白）和酪蛋白膠束發生共沉淀，乳清蛋白覆蓋在膠束表面分散于牛奶的超濾液中，在HCT-pH曲線上表現出最大值。在較高pH值下（pH＞6.9）加熱時導致乳清蛋白和富含κ-酪蛋白的蛋白從膠束中解離，殘余膠束變得不穩定，在HCT-pH曲線上沒有最大值和最小值。在牛奶預熱過程中（140℃，1min，pH6.7）形成的乳清蛋白-酪蛋白膠束復合物在再次加熱過程中（140℃，1min，pH＞6.9）從膠束中解離。膠束態的酪蛋白的解離（有時可能與乳清蛋白復合）也許有效降低了pH6.9時膠束的Zeta電位，導致了HCT-pH曲線上的最小值。

如果pH6.4～7.2的牛奶間斷加熱5min或10min后，重新將pH值調回到起始pH值，則不發生凝固，甚至總加熱時間達4h也不發生凝結。但是，當pH6.4～7.2的去乳糖牛奶以同樣的方式進行熱處理，則pH＜6.9的穩定性翻倍，而pH≥6.9時下降，見圖2-23。pH6.6的去乳糖牛奶加熱一段時間（如1min），然后用水或鹽緩沖液稀釋過夜產生沉淀。

周期性地將加熱過的牛奶調整到起始pH值增加了磷酸鈣的沉淀，防止了鈣的再溶解（通過酸化效應或乳糖分解效應），增加了可以降低酪蛋白鈣敏感性還原產物的形成，抑制了賴氨酰丙氨酸的形成。因此在一定程度上防止了凝固，如將間斷性加熱5min或10min后的去乳糖牛奶的pH值周期性調整至起始pH值，增加了磷酸鈣沉淀，但與通常的牛奶不同，由于美拉德反應對賴氨酰丙氨酸形成的抑制作用，去乳糖牛奶中酪蛋白的鈣敏感性可能增加。pH＜6.9的去乳糖牛奶的HCT翻倍，可能是由于磷酸鈣的沉淀（周期性中和的結果）而導致Ca^2＋損耗的增加；而pH≥6.9時HCT增加，可能是由于形成賴氨酰丙氨酸而導致酪蛋白的鈣敏感性增加。鈣敏感性增加可能也與去乳糖或去乳糖/去尿素的牛奶在140℃僅加熱1min就產生沉淀有關。

（二）pH值變化的可逆性

Rose和Tessier的數據顯示在110℃超濾獲得的牛奶漿液的pH值約為5.9。由他們的數據外推至140℃可知，140℃時pH值大約為5.5，并且可能對外推曲線的曲率的依賴性較小。磷酸鈣的pH值漂移平衡很快就能實現（平衡在5min內就可以達到）。這就是說，140℃下牛奶的pH值在5min內可以從6.7降至5.5。

熱致產生的pH值變化是可逆的，但在冷卻時重新建立平衡是很緩慢的，特別是在劇烈的熱處理后。Sweetsur和White將牛乳樣品冷卻至20℃后10min時立即測定pH值，此時平衡還未達到，這時的pH值部分是由于乳糖產生的酸得到的，部分是由磷酸鈣沉淀產生的，但其影響程度尚不能確定。

pH≤6.9溫度高于90℃時加熱牛奶10min，乳清蛋白與酪蛋白復合并發生共沉淀，而當較高的pH值下（pH7.3）加熱時，含有乳清蛋白和高酪蛋白含量的蛋白從膠束中解離。缺乏酪蛋白的膠束比有乳清蛋白覆蓋的膠束或天然膠束對熱、Ca^2＋、乙醇更為敏感，可以很快地被凝乳酶所凝固。在預熱前將分離的κ-酪蛋白加入脫脂奶中，它并沒有和膠束聚合（pH＞6.9）。十二烷基磺酸鈉增加了非沉淀氮（NSN）和N-乙酰神經氨酸（NANA）的水平，并使NSN-pH曲線和NANA-pH曲線向酸性方向漂移；而十六烷基三甲基銨溴化物則有相反的效果。這說明這種依賴于pH值的κ-酪蛋白膠束的解離是可逆的，依賴于膠束表面的電荷；在一定的負電荷下，疏水鍵和靜電鍵斷裂，導致κ-酪蛋白從膠束中解離。

（三）加熱過程中pH值變化導致的熱穩定性變化

一些實驗證明加熱時pH值的降低是導致牛奶在加熱過程中凝結的最重要的影響因素。尿素對牛奶的穩定性作用可以推斷為熱分解后的pH緩沖能力。Fox（1964）將一個pH6.70的樣品在140℃加熱10min后pH值降至6.14。將樣品pH值重新調至6.70，在140℃重新加熱10min，pH值又降至6.21。將pH值又重新調回6.70。這個加熱-重新調整pH值的循環總共進行了八次，從每一個樣品中取出1.5mL在140℃加熱至凝結。從每個樣品中取出10mL于30mL試管中在140℃加熱，加熱時間依據各自的熱凝結時間，然后冷卻至20℃，測定pH值，結果如表2-7所示，與Pyne的結果一致，如果牛奶的pH值偶爾調至其起始pH值，它的熱穩定性或多或少是無窮的。

三、乳中礦物質對熱穩定性的影響

隨著溫度增加、pH值升高，磷酸鈣的溶解性下降；在120℃、pH6.8時，磷酸鈣溶解性有一顯著下降，這與HCT-pH曲線上最低點一致。

加熱時磷酸鈣沉淀可能以一種羥（基）磷灰石Ca₁₀（PO₄）₆（OH）₂的形式存在。這與固有的酪蛋白磷酸鈣（CCP）不同，CCP含有3個磷酸鈣·檸檬酸氫鈣和2.5個磷酸鈣·磷酸氫鈣·0.5檸檬酸鈣。檸檬酸鹽在加熱時不會沉淀，這也許是由于組成不同造成的。熱沉淀的磷酸鈣在冷卻時甚至pH4.7時可溶性較差，低于固有的CCP，特別是溫度大于110℃時可溶性更差。當加熱的牛奶冷卻時由于鈣和磷酸根的原因變得不飽和了，部分原有的CCP溶解而恢復了平衡。

牛奶中熱沉淀的磷酸鈣可以通過酪蛋白膠束結合而防止沉淀。酪蛋白膠束結合的機制尚不清楚，可能是通過羧基，降低膠束的Zeta電位和水合能力。熱沉淀的磷酸鈣可能會覆蓋在酪蛋白膠束的表面。

在加熱過程中發生的一些變化實際上增加了熱穩定性。這些變化從圖2-23中看是顯然的，圖2-24是牛奶樣品在140℃加熱0～20min時pH值對凝結溫度的曲線。被加熱樣品穩定性提高的一個可能的原因是降低了加熱過程中Ca^2＋濃度，但這還未能用實驗來證明。Pyne認為在加熱過程中酪蛋白對Ca^2＋的敏感性降低，但這個變化的本質尚不清楚。

四、乳中膠態磷酸鹽對乳熱穩定性的影響

很早以前我們就知道，乳中的膠束有兩個主要成分——磷酸鈣鹽和酪蛋白酸鈣。1915年，Van Slyke發表了一篇文章開始討論磷酸鈣以及它們和酪蛋白之間的鍵。其中包括兩個問題：①磷酸鈣是二價或三價鈣鹽還是二價與其他形式的混合物?②磷酸鈣是完全或部分以化學鍵與酪蛋白相連，還是只是一種吸收現象?

由于缺乏關于有多少鈣與酪蛋白直接相連的知識，所以我們試圖采用分析各種牛奶組分的方法測定膠態磷酸鈣的組成總是失敗。酪蛋白含有大量酯化磷酸基團，盡管它們都表現為單一酯化磷酸鹽，但不可能計算與鈣發生反應的磷酸鹽中的游離酸基的范圍。酪蛋白也含有能與鈣反應的羧基。能與酪蛋白相連的鈣的數量是相當大的，所以在估計上的一個小小失誤都會使無機磷酸鈣的計算無效。

發展了許多滴定方法來估計牛奶中的磷酸鈣的組成。Pyne和MeGann使用一種稀釋滲析的方法不明顯改變酪蛋白中鈣的含量就可以去除無機磷酸鈣。由此得出結論，無機磷酸鈣實際是一種磷灰石類的磷酸鈣-檸檬酸鈣的復合物。新沉淀的磷酸鈣存在兩種形式：①可能是一種凝膠態的八聚磷酸鈣，鈣磷比（以物質的量計）為1.33∶1，它有很高的活動性可以將H^＋交換為CaOH^-，當鈣磷比接近1.66∶1時形成沉淀；②一種粒狀形式很可能是有核的磷酸二鈣，但它很快就轉變成堿性鹽，鈣磷比為（1.2～1.6）∶1。與磷酸鈣相關的任何鹽類不可能是從液相中的鈣和磷而來，二聚磷酸鈣（Ca₂HPO₄）只在很小的離子濃度和pH值范圍內在液相中穩定。

檸檬酸鹽趨向于延緩二聚磷酸鹽和其他粒狀鹽在穩定的鈣離子濃度下的沉淀，但不顯著影響沉淀形成的類型。根據Boulet的數據，檸檬酸鹽可以不同程度地與粒狀鹽結合，這主要取決于轉化的條件。在這方面檸檬酸鹽與碳酸鹽相似。牛奶中的分散相和液相都是復合的、可變的，并且都與導致或伴隨凝固的反應相關。即使在同一牛奶中，沉淀相的粒子也不是唯一的。通過直接分餾和分析技術已經證實離子的大小和組成是變化的，同一種牛奶中粗糙微小的離子的行為也證實了表面組分的不同。由于這種復雜性，尚可能在近幾年中被徹底解釋。但是我們可能可以很好地定義這些組分的化學和生物化學性質。進一步的研究將集中于形成和影響天然膠束的性質的小組分和它們之間的相互反應。

Hart（1919）把乳的熱穩定性差異主要歸因于乳中鹽含量的不同，按其理論最穩定的乳中，Ca、Mg之和對磷酸鹽、檸檬酸鹽之和應有合理的值，偏離此值乳的穩定性下降，低穩定性乳常歸因于過量Ca、Mg的存在。Rogers（1921）、Holm（1923）認為乳中鹽濃度和熱穩定性間沒有直接關系，pH值和乳鹽平衡使乳有最好的熱穩定性，加工者應用鈣鹽改善惡劣濃縮乳的穩定性。溶解鹽類尤其是鈣和磷酸鹽在原料乳和濃縮乳的熱穩定性方面有重要作用。鈣鹽增加，熱穩定性下降（此時Ca^2＋濃度增加，CCP增加，pH值下降），若增加檸檬酸鹽和磷酸鹽以減少Ca^2＋的濃度，此時CCP減少，乳穩定性增加。

Morrissey（1969）研究表明，若可溶性鈣和鎂在正常乳中由13mmol/L減至11mmol/L，最不穩定性的區域穩定性增加，最大穩定性的區域穩定性減少，此時A型乳轉化為B型乳。反之增加Ca^2＋濃度降低了最小穩定性區域的穩定性。Sweetsur和White（1974）證實，增加乳鹽濃度在pH6.7以下可增加穩定性，在pH＞7.3處形成第二個穩定性最小的區域，A型乳轉化成B型乳，最大穩定性區域的穩定性減小，最小穩定性區域的穩定性增加。水的稀釋（40mL水/100mL乳）增加最小穩定性區域的穩定性，對最大穩定性區域沒有影響。

膠體磷酸鈣（CCP）在乳的酪蛋白結構中起著重要作用，Pyne等人應用酸化或滲析技術去除膠體磷酸鈣后明顯增加了乳的熱穩定性，Fox等人研究表明，去除40%的CCP在最差穩定性區域可增加穩定性，若CCP去除60%以上pH＞7.1，乳的熱穩定性下降，CCP增加一倍在整個pH值范圍內使乳熱穩定性稍有下降。

將牛奶中的膠態磷酸鈣含量減少40%或增加20%不會顯著影響κ-酪蛋白膠束與pH值相關的熱致解離。但可溶性鈣和磷酸鹽的改變顯著影響了κ-酪蛋白的解離。降低磷酸鹽的濃度或增加鈣的濃度減少了非沉淀氮（NSN）和非沉淀N-乙酰神經氨酸（NANA）的形成。將牛奶對水進行短時間透析（約5h），減少了非沉淀氮（NSN）和非沉淀N-乙酰神經氨酸（NANA）的形成，此時NaCl濃度大于0.05mol/L。用琥珀一酰化改性蛋白質的氨基促進了κ-酪蛋白的釋放，而羧基的酰氨化則具有相反的效果。這表明加熱的牛奶在90℃以上加熱時產生的與pH值相關的κ-酪蛋白的解離是由靜電反應所控制的。如Ca^2＋、Na^＋等可溶性離子的作用表現為磷酸絲氨酸基團、羧酸基等蛋白質上的負電荷基團的保護作用，這樣減少了κ-酪蛋白的釋放。

鎂存在于牛奶中，研究已經證實鎂促進了更多的可溶性磷酸鈣（凝膠狀的）的分散，同時伴隨少量粒狀鹽的沉淀。鎂還延遲了二聚磷酸鈣向堿性形式的轉化，但并沒有進入這些鹽類的結構。

五、泌乳期對熱穩定性的影響

一般原料乳熱穩定性的不同，一定是由于組成上的差異引起的，通常有較大的季節性影響。乳牛個體之間的差異也相當大。

Dyson Rose（1961）曾對處于不同哺乳期的個體奶牛所產牛乳的組成和熱穩定性進行研究。結果發現，在哺乳期的早期和晚期時，牛乳中大部分成分的濃度都高于哺乳中期，其易變性的乳清蛋白含量過高（如圖2-25所示）。例外的是β-酪蛋白，它在哺乳早期處于正常范圍，但哺乳晚期趨于下降。此外，初乳和末乳的pH值也不在乳的最穩定pH值范圍內。季節對熱穩定性的影響已有廣泛的報道，它主要受飼料、氣候等影響。可溶性非有機磷在哺乳晚期含量也較低；而總檸檬酸鹽、可溶性檸檬酸鹽和可溶性鈣在整個哺乳期中有明顯的下降。

Andrew等（1999）發現，哺乳早期和哺乳中期牛奶中總乳清蛋白的變性速率基本相似，但哺乳晚期則相對較高。哺乳晚期的牛奶中單一乳清蛋白的變性速率也比較高，這可能是由于總乳清蛋白濃度較高。哺乳晚期的牛奶中含有較多的易變性的免疫球蛋白、血清白蛋白/乳鐵蛋白組分。

六、溫度對熱穩定性的影響

Rose（1962）的研究表明，預熱對乳熱穩定性的影響是使熱穩定性-pH曲線向酸性區域稍有移動，即在預熱過程中熱穩定性變化是pH值下降的函數，若預熱前乳的pH值增加，最大穩定性的pH值進一步移向更酸的區域。120℃、20min或150℃、1.5min的預熱在熱穩定性最小的區域增加了乳的熱穩定性，將A型乳轉向為B型乳。100℃、5min的預熱乳增加了最終產品濃縮乳的熱穩定性，這在商業上已用于蒸發乳和熱穩定性乳的加工。商業上常采用下列預熱溫度和時間：80～90℃、30min（澳大利亞）；95℃、10min（愛爾蘭）；105～120℃、30～180s（新西蘭）。長期以來已經認識到預熱牛奶比濃縮更有利于穩定性。Rose采用的最強烈的預熱處理是120℃、10min。對牛奶進行更劇烈的預熱處理對熱凝固時間（HCT）-pH值曲線有一個有趣的影響（如圖2-26所示）。在pH6.3～7.1的范圍內，在120℃預熱10min導致穩定性下降，但進一步加熱時在最小值范圍內穩定性增加，140℃預熱20min可以獲得一條B型曲線，在整個pH值范圍內進一步加熱導致穩定性增加。Davies也報道高預熱溫度使穩定性增加。

Roger（1999）等對預熱溫度對未經濃縮的牛奶的熱穩定性影響進行了研究。

（一）冷卻對預熱過的牛奶的熱穩定性的影響

當pH6.4～7.2的牛奶在90℃預熱1h（圖2-27）后，70℃預熱15h后，然后冷卻到20℃（圖2-28），則它們在140℃的熱穩定性基本與未經預熱的牛奶保持一致。但是若在100℃預熱1h，則140℃的穩定性降低，特別是在140℃測定前冷卻到20℃（圖2-27）。當牛奶在100℃預熱1h（pH6.4～7.2）后不經冷卻而直接以設定的速度從100℃升溫至140℃（圖2-29），則熱凝固時間和溫度與未經預熱的牛奶相似。但同樣預熱的牛奶先冷卻到20℃，然后再浸沒在100℃油浴中，油浴的溫度按設定的速度升至140℃，則牛奶的熱穩定性顯著下降，見表2-8。這些結果表明當溫度＜100℃時的一些熱致變化，如乳清蛋白的變性和膠束態酪蛋白的降解可能損害了牛奶在140℃時的穩定性；只有當預熱的牛奶經過冷卻時，升溫過程中發生的反應可能短時間地增加牛奶蛋白之間的疏水相互作用，當再次加熱溫度達到70℃時，達到最大值。

HCT_t指的是脫脂牛奶自20℃或100℃加熱至凝固溫度（即HCT_p）所需時間。加熱速率為3.75℃/min（自20℃至65℃），2.75℃/min（自65℃至90℃），1.75℃/min（自90℃至120℃）和1.12℃/min（自120℃至140℃），見圖2-27。

（二）140℃預熱的影響

當pH6.4～7.2的牛奶在140℃加熱，以5min的時間間隔冷卻到20℃，整個的加熱時間比未預熱的牛奶HCT長30%～40%（圖2-30）。間斷加熱牛奶的凝固點pH值比連續加熱牛奶的凝固點pH值低0.1，表明前者酪蛋白的熱穩定性略優于后者。

圖2-31的結果表明同樣的牛奶在HCT-最大或HCT-最小的pH值下140℃加熱2min、4min、6min、8min或10min后，4℃過夜，然后將pH值調整到起始pH值，HCT-最大pH先降低，而當預熱時間延長至4min時有上升，而HCT-最小pH則在整個過程中持續下降。

圖2-32是在牛奶加熱時加入0～7mmol/L的乙二醛（乳糖的一種熱降解還原產物），當濃度為1mmol/L時HCT-最大pH降到最小值，但濃度高于2mmol/L時則上升。與預熱的效果相似，乙二醛濃度增加時HCT-最小pH也增加。由于牛奶中還原產物在140℃加熱的早期階段形成，乙二醛濃度增加產生的影響與140℃預熱產生的影響類似，這可能是美拉德反應對牛奶在140℃的穩定性有很大的影響，這也解釋了為何關于在UHT溫度預熱牛奶對熱穩定性影響的報告不能總達成一致。

似乎有效的還原產物只在HCT-最大pH值下140℃加熱超過4min時形成，用N2代替空氣對HCT-最小pH也或多或少有穩定作用。預熱的效果隨自身尿素濃度的變化而變化，它對美拉德反應和濃縮的或未濃縮的牛奶的熱穩定性有明顯的作用。Kelly報道，尿素通常不增加濃縮牛奶的熱穩定性，在預熱或噴霧干燥前加入則增加了熱穩定性。

七、乳糖對熱穩定性的影響

乳糖會降低乳的熱穩定性，若添加65g/L乳糖于乳中，在整個pH值范圍內降低了乳的熱穩定性。

與通常的牛奶不同，由于美拉德反應對賴氨酰丙氨酸形成的抑制作用，去乳糖牛奶中酪蛋白的鈣敏感性可能增加。pH＜6.9的去乳糖牛奶的HCT翻倍，可能是由于磷酸鈣的沉淀（周期性中和的結果）而導致Ca^2＋損耗的增加，而pH≥6.9時HCT增加，可能是由于形成賴氨酰丙氨酸而導致酪蛋白的鈣敏感性增加。鈣敏感性增加可能也與去乳糖或去乳糖/去尿素的牛奶在140℃僅加熱1min就產生沉淀有關。

Tan-Kintia和Fox（1999）發現未間隔加熱的去乳糖牛奶的HCT-pH曲線在pH7.1～7.2有一個第二HCT-最大pH值，如圖2-23所示。此時凝固很少，凝固物很松散。這也許是由于當pH＞7.4不間斷地加熱去乳糖牛奶時，鈣敏感性的增加快于Ca^2＋的降低。除了由于中和時加入堿而導致的曲線的漂移，pH6.3～7.3間斷性加熱和中和去乳糖牛奶得到的HCT-pH曲線可能與不間斷的加熱pH7.0～7.4的去乳糖牛奶的HCTpH曲線相似。

與不間斷加熱去乳糖牛奶不同，在pH≥7.4間斷加熱去乳糖牛奶的穩定性較高（見圖2-24），這可能是由于在加熱過程中磷酸鈣沉淀增加，彌補了由于酪蛋白的鈣敏感性增加而導致的不穩定效果。