第一節　牛乳的熱穩定性

一、加熱時牛乳蛋白質的變化

牛乳蛋白質受熱變性，溫和的熱處理（即生產上常用的熱處理）不影響乳蛋白的一級結構和肽鍵，而是作用于二級結構和三級結構。牛乳蛋白質在80℃左右開始變性，而且這種變性是部分可逆的。

（一）酪蛋白的變化

乳蛋白對加熱是否穩定的性質稱為熱穩定性。通常以在給定的溫度下，產生可見的乳凝固所需要的時間來定義熱穩定性。酪蛋白比較穩定；乳清蛋白基本對熱不穩定，容易發生熱變性。酪蛋白溶液于100℃下加熱30min，幾乎沒有變化；于120℃下加熱30min，可發現電泳圖譜的變化，γ-酪蛋白及β-酪蛋白的峰趨向扁平，發生部分水解和脫磷酸；于140℃以上的溫度加熱時，則開始凝固。事實上，所有的天然酪蛋白都有不同程度的化學改性，因此被認為是一種天然的變性蛋白。當酪蛋白遭受強烈的熱處理時，它確實發生一些變化，其中主要是水解。

酪蛋白不易變性，而且乳的熱凝固對溫度的依賴性比蛋白熱變性對溫度的依賴性弱得多。加熱后酪蛋白發生凝集，并由于加熱后乳漿組成變化很大，即使恢復到原來的環境，聚集體也不能再溶解，甚至添加斷裂氫鍵的試劑，減少—S—S—鍵的聯結等，聚集體仍保持原樣。因此，酪蛋白在加熱后無疑是發生了化學變化。研究顯示，高溫下的酪蛋白經歷了脫磷酸、部分水解和幾步交聯反應。

120℃加熱30min后產生-胨氮（PPN）4.7%～6%（以總氮計）。殺菌前牛乳中的-胨是組成β-酪蛋白和脂肪球膜蛋白（pH4.6，牛乳煮沸時蛋白質不沉淀）的解朊部分。滅菌牛乳中所產生的-胨最有可能來自肽鍵水解或裂解，但這方面的機制至今尚未闡明。120℃加熱30min，可增加牛乳中非蛋白氮（NPN）含量，為總氮的5.5%～7.5%。NPN溶于12%的三氯醋酸。NPN的產生很有可能是蛋白加熱中谷氨酸和天冬氨酸脫氨基作用，釋放氨氣所造成的。關于這一說法尚未有確鑿證據，但對酪蛋白鹽溶液（pH6.9）135℃加熱30min后，發現NPN的生成量與蛋白質的酰胺氮相等。通常巴氏殺菌、UHT產生的-胨氮或NPN是微量的。

1.熱處理對酪蛋白的某些物理性質的影響

酪蛋白在100℃以下加熱，雖然其化學性質沒有什么變化，但加熱對其物理性質卻有明顯影響。牛乳經63℃以上的溫度加熱后，用酸或凝乳酶凝固時，凝乳的物理性質發生變化；牛乳經63℃以上溫度加熱后，加酸生成的凝塊細小而柔軟，用凝乳酶凝固的凝塊也比較柔軟；用100℃處理時尤為顯著，其凝固時間則隨加熱溫度的升高而延長。牛乳加熱時酪蛋白的變化與乳清蛋白的熱變性有復雜的關系，如牛乳經高溫加熱后，由于乳清蛋白變性而使黏度增大，影響稀奶油的分離；而經63℃，30min的低溫保持殺菌后立即冷卻的牛乳無此現象。我們將在后文中對此進行詳細論述。

2.酪蛋白體積的變化

低于90℃的熱處理對蛋白的體積變化影響很小，UHT殺菌后膠束體積增加，Mohammad和Fox（1987年）研究了140℃10min熱處理的酪蛋白膠束，發現其直徑增加，膠體粒子的分布范圍縮小。Dalgleish等人（1987年）測得130℃加熱時，酪蛋白的平均半徑在起始階段緩慢增加，至有可見絮凝物生成前，半徑迅速增加。

pH也影響受熱酪蛋白的半徑變化。加熱時pH由6.7變化為6.9，其平均直徑增加，若pH繼續上升至7.2，則膠體半徑明顯下降。

加熱過程從酪蛋白中解離的小顆粒物質明顯增加，許多研究表明，在高溫情況下κ-酪蛋白從酪蛋白膠體上解離出來，解離量和加熱的溫度與時間、酪蛋白濃度、可溶性鹽、pH密切相關。

Tomotada等研究了加熱導致的酪蛋白膠束大小的變化。通過離心方法獲得不同大小的酪蛋白膠束。采用Sephacryl S-100凝膠過濾柱分析膠束大小的分布。除了140℃加熱外，則無論在加熱過程是否存在乳清蛋白，大膠束和中等大小膠束的體積分布都沒有發生變化，但小膠束的大小上升為中等大小。而在140℃加熱時，若有乳清蛋白存在，則大膠束聚合了，而小膠束和中膠束的大小則上升為大膠束的尺寸。當膠束混合物加熱超過120℃時，中膠束和小膠束都上升到大膠束的尺寸。因此中膠束通過與小膠束結合而使體積增加，而小膠束通過與中膠束和大膠束結合使體積增加為大膠束大小。這個結果表明小膠束是膠束體積增加的重要因素，乳清蛋白則是膠束結合的促進劑。

我們設想膠束表面會發生一些變化，因此膠束可能會在加熱過程中相互反應，甚至在沒有乳清蛋白存在時，這種反應仍然存在。為了使相互反應成為可能，膠束表面的蛋白質盡量互相不結合，而在加熱過程中釋放，我們測定了釋放的蛋白質的數量和組成。結果發現加熱到120℃時釋放了4%的蛋白質；當加熱至140℃時釋放的蛋白質數量增加至20%。釋放的蛋白質包括β-酪蛋白、α_s1-酪蛋白和κ-酪蛋白，較大的膠束似乎釋放出更多的β-酪蛋白。α_s1-酪蛋白和κ-酪蛋白的比例為1（不考慮膠束大小）。根據1989年Ono報道α_s1-κ-酪蛋白復合物是定位于膠束表面的酪蛋白膠束的亞基之一。由此表明加熱時膠束表面的酪蛋白復合物釋放出來。

考慮到釋放的蛋白質是膠束表面的亞基，因此需要分析表面的親水性。加熱到120℃時大酪蛋白膠束的親水性翻倍，而中膠束和小膠束的親水性并沒有變化。既然大膠束的體積在加熱時沒有發生變化，則說明釋放出蛋白質后而暴露的表面親水部分沒有被其他結合的膠束所覆蓋，這些區域保持在膠束表面。這就解釋了為什么當小膠束和較大膠束通過加熱而和暴露的疏水部分結合時，小膠束和中膠束的疏水性沒有變化。研究還表明疏水區域并未大到足以結合大或中膠束，但足以結合小膠束。

由此得出如下結論，加熱時α_s1-κ-酪蛋白亞基從酪蛋白膠束表面釋放，疏水區域暴露。暴露的部分并未大到足以結合大或中膠束，但可以結合小膠束。膠束表面的疏水性通過吸收變性的乳清蛋白而增加，這促進了酪蛋白膠束的相互結合。小膠束在膠束體積增加方面似乎起關鍵性作用。

3.酪蛋白的熱凝固

酪蛋白的脯氨酸（占總酪蛋白的11.2%）能阻止蛋白質凝聚所需的氫鍵形成，所以對熱較穩定。當受熱強度達到125℃、60min，酪蛋白開始凝聚變性，但這種強度的加熱幾乎不會出現在乳制品生產中。稍弱的加熱強度會導致酪蛋白折疊結構的解體，如UHT殺菌會使得酪蛋白變得松散，顆粒的直徑增加。酪蛋白熱凝固的原因不同于β-乳球蛋白熱變性的原因。高溫下酪蛋白經歷了脫磷酸、部分水解和幾步交聯反應。

蛋白質加熱過程中涉及絲氨酸磷脂、硫醇、二硫化物、賴氨酸和酰胺側鏈的反應，也有部分肽鏈可能發生裂解。酪蛋白側鏈極易發生熱誘導反應。球狀乳清蛋白則由于熱變性，很容易展開其多級結構。多肽鏈中的肽鍵基本上是反式構象（trans），但肽鏈展開情況下易發生異構化，生成不穩定的順式（cis）構象，但脯氨酸殘基是個例外，它的順、反式構象均相當穩定，因此其異構化比較困難。一旦發生異構化則可能影響到蛋白質的反應速率，且冷卻后不易恢復到原來天然的狀態。但有關這類反應的數據仍很零碎，因此我們不可能僅僅基于活化能之類的基本參數對它們進行比較。

120℃加熱1h有近50%的酪蛋白酸鈉去磷酸化，5h后去磷酸化徹底完成。TCA可溶性氮的形成速度遠低于P的釋放速度（約20%的總氮在120℃5h內是穩定的），這說明TCA可溶性P的增加不是因為蛋白質水解產生的。部分去磷酸化的酪蛋白比其他酪蛋白的熱穩定性更好，可以結合更少量的Ca^2＋。可以認為這兩個因素與酪蛋白的熱凝結有很大關系。

4.酪蛋白酸鹽的裂解

熱處理能使酪蛋白的磷酸絲氨酸裂解，產生磷酸鹽（酯）；該反應常在脫脂乳或酪蛋白鹽溶液100～140℃，加熱1h情況下發生。酪蛋白的磷酸鹽（酯）裂解反應速率隨pH值從6.0上升到7.0而增加。在牛乳正常pH值范圍內，該裂解反應的活化能分別是：對酪蛋白鈉為117kJ/mol，酪蛋白鈣為109kJ/mol。裂解發生可以有兩種解釋，其一是水解作用，生成絲氨酸殘基（見表2-1反應3）；其二是β-消去，產生脫氫丙氨酸（見表2-1反應4）。β-消去在堿性溶液（如酪蛋白在0.1mol/L NaOH中，30℃）中確能發生。水解作用則在低pH值下較易發生。不管是發生哪一反應（或同時發生），分解反應的進程都可通過測定絲氨酸和脫氫丙氨酸而得知。有實驗表明，κ-酪蛋白溶液在滅菌溫度加熱時慢慢失去其穩定酪蛋白膠束的能力。廣義來說，κ-酪蛋白比β-酪蛋白熱敏性高。

5.酪蛋白的去磷酸化

如上所述，酪蛋白去磷酸化后，熱穩定性更好。加熱后酪蛋白對Ca^2＋的穩定性也顯著降低，這是由α_s-酪蛋白而不是κ-酪蛋白的酶促去磷酸化導致的。酪蛋白的去磷酸化在牛奶中的速度低于在酪蛋白酸鈉中的速度：120℃，90min內有12%發生去磷酸化，120℃，30min內有18%發生。

酪蛋白酸鈉和脫脂牛奶的加熱去磷酸化在110～140℃時反應呈一級動力學，在pH6.0到pH7.0范圍內與pH值無關；酪蛋白磷酸鈉有117～121kJ/mol的活化能（與O-磷酸絲氨酸相同），脫脂牛奶有104.5～113kJ/mol活化能。濃度增加加快了去磷酸化反應速率，預熱處理對未濃縮牛奶的去磷酸化速度無影響，但降低了濃縮乳的去磷酸化速度。α-酪蛋白和β-酪蛋白以同樣的速度去磷酸化。因此可以預計去磷酸化對牛奶的熱凝固有貢獻，但這種貢獻尚不能定量。

脫磷酸化和蛋白水解：酪蛋白磷酸鍵和肽鍵的水解緣于酶作用或熱處理，早期的研究表明，酪蛋白鈉在高溫時的脫磷酸化快于酪蛋白，如120℃，20min的熱處理后，牛奶損失絲氨酸磷酸鹽10%，而酪蛋白鈉則損失15%，反應呈一級反應，活化能104.5～121.2kJ/mol。Dalgleish等人（1987）報道經130℃，60min熱處理后，酪蛋白磷酸鹽的2/3被水解，絲氨酸磷酸鹽連接膠體磷酸鈣和酪蛋白，脫磷酸化意味著酪蛋白的解離。高溫處理如135℃，60min使總氮量的10%～20%轉化為非蛋白氮，巴氏殺菌或UHT殺菌時非蛋白氮變化很小。

6.酪蛋白在加熱時的水解

加熱處理中，使酪蛋白磷酸鈉溶液中形成5%TCA可溶性氮的反應與時間呈線性，120℃5h后約有20%總氮可溶化。這一結果與大量的實驗相一致，其中最詳盡的是White和Davies，他們證明牛奶中10%～20%總蛋白氮在135℃，60min處理后轉化為非蛋白氮（NPN）。NPN的形成與時間呈線性關系。Dalgleish等人（1987）報道130℃，60min熱處理酪蛋白磷酸鹽的2/3被水解。高溫處理如135℃，60min使總氮量的10%～20%轉化為非蛋白氮，巴氏殺菌或UHT殺菌時非蛋白氮變化很小。

加熱可以明顯改變酪蛋白在醋酸纖維上的電泳組分及在Sephadex和Bio-gel上的洗脫曲線。盡管140℃加熱10min后，酪蛋白酸鈉溶液中仍保留了一些降解產物，但含有5mol/L尿素的聚丙烯酰胺不能溶解其中的α_s-酪蛋白和β-酪蛋白。一種與凝乳酶水解酪蛋白時產生的巨肽有相同的化學和物理性質的肽類，在120℃加熱20min時從整個酪蛋白或已分離的κ-酪蛋白中分離。加熱產生12%的TCA可溶性硅鋁酸的形成曲線基本與時間呈線性關系，20%～30%的κ-酪蛋白在熱凝固點降解，結果與檢驗溫度無關。

牛奶在加熱過程中12%TCA可溶性肽和糖肽的釋放已經詳細研究過。糖肽在50℃或以上溫度釋放。除甘露糖以外，原連接在糖肽上的糖類由于熱而釋放，其數量少于凝乳糖肽上的數量，組成糖的相對數量隨加熱溫度而變。由于熱而釋放的糖肽中糖類和氮的比例較低，糖肽中還含有主要位于由凝乳酶產生的副κ-酪蛋白中的D-甘露糖，這些表明了凝乳酶和熱水解了不同的鍵或另外的鍵因熱而被水解。

κ-酪蛋白穩定α_s-酪蛋白，防止因Ca^2＋而沉淀的能力，由于對分離的κ-酪蛋白進行相對溫和的熱處理（100℃，5min）而被減弱或破壞。在這個溫度下，κ-酪蛋白的變化是非水解的，高度依賴于離子環境，并被認為是由于分子間的聚集產生的，其中可能包括二硫鍵、氫鍵和疏水鍵的反應。如果形成了一種可以穩定κ-酪蛋白不使其聚集的α_s-酪蛋白或κ-酪蛋白的復合物，就可以防止熱導致κ-酪蛋白變性。而分離的κ-酪蛋白在90℃強烈聚合。

由κ-酪蛋白與膠束中的其他酪蛋白聯合可以提供保護作用，因此κ-酪蛋白的熱致聚集變化不可能是牛奶熱穩定性的主要影響因素。但是κ-酪蛋白在更強烈的加熱條件下的水解具有很重要的意義，特別是pH＞7.0時。不考慮檢測溫度，約有25%的κ-酪蛋白在熱凝固點水解，說明這是熱凝固的一個關鍵因素。

7.酪蛋白Zeta電位的變化

各種研究報道了酪蛋白膠束的不同的Zeta電位或表面電位，26℃和5℃時分別有8mV、26～51mV、-17.4mV、-26.8mV，6℃和30℃分別為44.5mV、-14.3mV、-19.6mV，20℃時-14.3mV。Hankinson和Palmer發現了Zeta電位和水解在膠束穩定性上的意義，現在廣泛認為κ-酪蛋白的凝乳水解降低了膠束的Zeta電位，可能導致了通過范德華力產生的聚集。

高溫加熱使酪蛋白膠體的Zeta電位減小，這緣于加熱過程中κ-酪蛋白的水解，α_s1-酪蛋白、α_s2-酪蛋白和β-酪蛋白的脫磷酸化，pH值的降低和磷酸鈣的沉淀及美拉德反應等。也有多種文獻報道經120～135℃的熱處理Zeta電位的變化很小。在高溫時無法測定，經冷卻后熱誘導變化的Zeta電位是否又可逆復原現尚未清楚。

通常認為在檢測溫度時不可能測定Zeta電位，但Darling和Dickson卻認為這種變化不是隨溫度一致變化的，微小的增加或減少都可以被記錄。如果牛奶的pH值在加熱過程中降低，則說明在固定的pH值時Zeta電位實際是升高的。因此他們認為酪蛋白的熱致凝固不是由于電荷中和而可能是由于疏水或范德華反應。不過他們只測試了三個樣品，因此結果需要進一步的確認和延伸。

8.酪蛋白膠束的解離

關于劇烈熱處理對酪蛋白膠束的影響（如導致聚集等），研究得較少，相當多的工作著眼于殺菌過程（特別是UHT過程中）的膠束變化。這些研究者都同意在殺菌和后繼的貯藏過程中確實存在膠束的聚集，但在聚集的本質上存在分歧。有研究發現，當溫度高于110℃時，酪蛋白膠束開始聚集。

已經證明，分散在經過90℃，30min加熱的牛奶中的酪蛋白膠束是非沉淀酪蛋白（105000g，30min）。這說明分散是由于膠束中的鈣被可溶性檸檬酸鹽螯合，因為檸檬酸鹽通常是被可溶性鈣中和的，這些鈣因加熱過程中產生磷酸鈣沉淀而變為“游離”。在高pH值的環境中，游離的檸檬酸鹽溶解了膠態鈣。

已經證實，在135～140℃加熱15s到4min時，酪蛋白具有增溶性。κ-酪蛋白代表了40%左右的可溶性酪蛋白。同蛋白質的分子間反應一樣，膠束鈣的增溶作用也被認為與膠束解離相關。

Fox曾用黏度、超速離心和滲析色譜法研究過酪蛋白膠束在加熱時的聚集-解離。在pH6.8時（熱凝固時間HCT-pH曲線的最大點），黏度先上升然后下降直到開始聚集，黏度很快上升。在pH7.2（堿性最小值）時黏度-時間曲線上最大值和最小值更為明顯。在熱凝固時間HCT-pH的最小值時，起始黏度先增加直至聚集，但在一個相對較低的檢測溫度時，黏度-時間曲線的最大值-最小值仍然處于最小pH值范圍內。

如此看來似乎是膠束先聚集后解離。聚集依賴于乳清蛋白，其曲線通常與酪蛋白膠束中游離蛋白在牛奶滲出液中的分散相近。但是如果降低Ca^2＋濃度，則不存在起始的黏度增加，而是基本保持不變直到聚集開始時再迅速增加。

以15000g離心牛奶或無血清蛋白酪蛋白膠束的懸浮液1h，可以沉淀近50%生奶中的酪蛋白。這表明兩個系統中可沉淀的總氮百分數在140℃加熱的早期階段（1～5min）是增加的，但開始聚集后便下降了。可溶性氮加熱時間曲線通常與黏度-加熱時間曲線相似。

多孔玻璃的滲析色譜表明，在140℃加熱的起始階段酪蛋白膠束的峰值是增加的，但若進一步加熱則開始下降。較顯著的膠束解離顯然是從140℃，20min后開始的（只先于可見的聚集），此時大約有50%的總蛋白質在可溶性蛋白質的峰中被洗脫。

9.酪蛋白膠束的水合

Fox等人（1981）發現，pH6.8，140℃，15min的熱處理減少了酪蛋白的水合作用。Ruegg等人（1979）發現加熱乳中酪蛋白膠體的平衡水含量明顯低于未加熱乳中酪蛋白膠體的平衡水含量，這預示著加熱減少了酪蛋白膠體的水合作用。Creamer和Matheson的研究表明，隨著pH值的下降，膠體的水合作用也下降，若pH值下降發生在熱處理過程中，則熱處理對酪蛋白膠體水合作用沒有實質性影響。已有一些研究著眼于HCT和酪蛋白的關系，但這種關系尚無定論。

膠束水合與Zeta電位的變化有密切的依賴關系。加熱過程中酪蛋白水合的變化尚未有報道。可以通過以下方法制備水合膠束：將140℃加熱0min、1min、2min、5min、10min、15min后的乳超速離心（90000g），起始pH6.8。結果發現水合作用確實有下降，這與已報道的Zeta電位的變化不一致。Zeta電位、加熱時的水合作用及其影響因素都需要更詳細的研究。

（二）乳清蛋白的變化

牛乳經熱處理后，其外觀發生的種種變化，不同程度地與蛋白質特別是乳清蛋白的熱變性有關。牛乳經高溫加熱后，由于乳清蛋白變性而使黏度增大，影響稀奶油的分離。而經63℃，30min的低溫保持殺菌后立即冷卻的牛乳無此現象。乳清蛋白不含磷，脯氨酸含量低（占總乳清蛋白的5.2%），而胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸含量較高，這些都導致乳清蛋白對熱非常敏感，熱變性程度是溫度和時間的函數。巴氏消毒乳的乳清蛋白變性比例達到10%～20%，間接加熱式UHT乳達70%～80%，直接加熱式UHT乳為40%～60%。

1.乳清蛋白的變性溫度

乳清蛋白的熱穩定性總體而言低于酪蛋白，相對地說，其中α-乳白蛋白的熱穩定性最高，β-乳球蛋白及血清白蛋白次之，免疫球蛋白最低。加熱30min時，它們的變性溫度分別是：免疫球蛋白70℃，血清白蛋白74℃，β-乳球蛋白90℃，α-乳白蛋白96℃。在此溫度、時間內，?、胨組分不變性。

2.熱處理對乳清蛋白的影響

脫脂乳中乳清蛋白的熱變性可見圖2-1，從圖中可以看出與一定的溫度及時間相對應的乳清蛋白熱變性的百分比，在此范圍內熱變性的程度隨溫度的上升而有規律地增大。

牛奶加熱時發生可逆的酪蛋白締合及蛋白質構形的變化，如β-乳球蛋白二聚體與其單體的轉化。大多數乳清蛋白的溶解性因熱變性而下降，溫度高于60℃時尤為明顯，乳清蛋白會與酪蛋白締合，但如前所述，不同的乳清蛋白具有不同的敏感性。免疫球蛋白失活時，同時也失去對細菌和脂肪球的冷凝集反應的抑制作用，這可能是加熱變性的緣故。

與酪蛋白相比，乳清蛋白相對熱不穩定，77.5℃加熱60min，80℃，30min或90℃，5min就徹底變性。在分離蛋白的溶液或乳清中，熱變性的乳清蛋白聚集沉淀的程度依賴于溫度、pH值和Ca^2＋濃度。但是變性的乳清蛋白在牛奶中并不直接沉淀而是在酸化、鹽析或超速離心時和酪蛋白共沉淀。變性乳清蛋白對沉淀的保護作用似乎是非特異性的，受所有酪蛋白組分影響，這可能與酪蛋白隱蔽了Ca^2＋有關。通常可以接受的是當共同加熱或將κ-酪蛋白加入預熱的β-乳球蛋白中時，它們通過巰基-二硫鍵相互變換反應。不太確定的是這樣的復合物是否是在加熱中形成的，這種復合物的分離狀態和復合體系中是否相似。毫無疑問，加熱牛奶時β-乳球蛋白和酪蛋白之間存在一些反應，這些反應顯著影響了牛奶的熱穩定性和凝乳酶聚集。提高pH值后的變性的乳清蛋白-酪蛋白膠束復合物發生解離，這可能與HCT-pH曲線上的最大值-最小值現象有關。

基本上所有關于β-乳球蛋白和κ-酪蛋白反應的研究都在80℃和90℃進行。目前沒有明確的證據說明β-乳球蛋白-α-酪蛋白復合物甚至在110℃或140℃也可以形成，這種觀點尚未得到證實。

盡管已有報道說在加熱過程中α-乳白蛋白和κ-酪蛋白不發生相互反應，而α-乳白蛋白和β-乳球蛋白確實發生反應，但這種復合物表現出與κ-酪蛋白的反應。Rose報道α-乳白蛋白不改變酪蛋白膠束懸浮液的HCT-pH曲線，但Fox和Hearn報道，對此α-乳白蛋白具有和β-乳球蛋白相同的效果。

采用聚丙烯酰胺圓盤電泳研究加熱對牛奶蛋白質的影響。根據遷移率降低的順序可將乳清蛋白帶分類，其中包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白（SA）和免疫球蛋白。將κ-酪蛋白和β-乳球蛋白分散在含有乳中正常礦物質的溶液中加熱至74.5℃保持30min，發現兩者發生了絡合；將其加熱至85℃時反應徹底進行。若將α-乳白蛋白或牛血清白蛋白（BSA）與κ-酪蛋白一起在同樣條件下加熱則不會發生反應。將β-乳球蛋白A和B在74.5℃或85℃保持30min，將出現一條共有的電泳帶，它的電泳遷移率較慢，這也許是因為在加熱過程中分子大小增加了或分子構形發生了變化。這種蛋白質在天然乳清中并不存在。

3.熱處理對乳球蛋白的影響

乳清蛋白的加熱變化直接或間接地與硫化氫的發生、加熱異味的生成、抗氧化性的發生等現象有關。β-乳球蛋白的量接近乳清蛋白總量的一半，而且β-乳球蛋白加熱后又容易發生變化，因此β-乳球蛋白的變化對乳制品有很大的影響。

β-乳球蛋白在30℃以下的牛乳中是以二聚體的形態存在的，在30℃以上則解離成單體的形態。在65℃以上加熱時，由于凝聚而使相對分子質量增大，隨后電泳遷移率增加。進而在85℃以上加熱時，—S—S—鍵裂解，產生游離巰基，甚至產生揮發性的硫化物和硫化氫。圖2-2表示了β-乳球蛋白加熱變性的過程。

有人采用色譜法對加熱導致的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的反應進行研究。通過實驗和計算發現，當單獨加熱β-乳球蛋白時，這種蛋白質的減少為14%；而加熱乳清蛋白時β-乳球蛋白的減少為36%，當一起加熱α-乳白蛋白和β-乳球蛋白時，減少值為84%。這說明當這兩種蛋白質一起加熱時，β-乳球蛋白改變了α-乳白蛋白的色譜性質。Sawyer等建議β-乳球蛋白和κ-酪蛋白的復合物是通過雙硫鍵連接的。

4.巰基的變化

蛋白質半胱氨酸上的巰基具有弱酸性，當溫度上升時極易解離。如表2-1所示，巰基可參與許多反應，游離巰基存在于β-乳球蛋白、乳清蛋白和脫脂球膜蛋白、二硫化物、α-乳白蛋白和免疫球蛋白中。每摩爾κ-酪蛋白中含2個半胱氨酸，α_s2-酪蛋白同樣含有2個半胱氨酸。研究表明在β-乳球蛋白中存在如下平衡：二硫化物Cys106-Cys119，Cys106-Cys121，巰基Cys119與Cys121。加熱溫度大于60℃，巰基暴露、活化并易于與許多試劑發生反應，這種活化巰基有時被稱為自由巰基。蛋白質的巰基釋放，作為蛋白質變性的重要指數之一已得到較深入的研究。

由于β-乳球蛋白熱變性產生活性巰基，特別是產生硫化物和硫化氫，給牛乳帶來了蒸煮氣味（cooked flavor）。一般對牛乳的熱處理程度越高，則牛乳風味的惡化也越顯著。除了β-乳球蛋白是活性巰基的主要來源外，脂肪球膜蛋白加熱后也能產生部分活性巰基。脫脂乳中的巰基量與加熱溫度、時間的關系見圖2-3。

活性巰基是強有力的還原劑，因此加熱后的牛乳的氧化還原電勢降低，并產生了抗氧化性。熱處理引起的牛乳的抗氧化性是有利的，在生產中應適當掌握，充分利用有利因素，盡量避免不利影響，從而可以提高乳制品的保藏性。

在空氣存在條件下加熱，部分自由巰基會氧化成二硫化物，溫度從60℃（20min）上升到125℃（20min）能加速該轉化過程。我們知道，牛乳中含巰基氧化酶，它能將巰基氧化成二硫化物。半胱氨酸殘基經氧化成二硫化物后，還能繼續氧化成磺基丙氨酸。至今仍未闡明牛乳蛋白質加熱過程除氧化生成二硫化物之外，是否進一步氧化。二硫化物可以在分子內或分子間形成，分子間形成二硫化物組成一聚合物。如表2-1中反應6所示，聚合也可來自二硫化物的相互交換反應，這一點已在β-乳球蛋白加熱至70℃得到證實。熱變性β-乳球蛋白易與κ-酪蛋白反應。

如表2-1反應8所示，牛乳加熱過程發生半胱氨酸巰基裂解（β-消去），生成脫氫丙氨酸的反應。β-乳球蛋白在pH6.9，97℃加熱80min后，每摩爾蛋白質產生約0.15mol脫氫丙氨酸，相當于15%的半胱氨酸殘基；在同樣的溫度時間條件，pH9.8的情況下，半數半胱氨酸發生裂解。有證據表明β-消去僅發生在巰基氧化成二硫化物之后。

牛乳加熱過程中釋放的揮發性硫化物（主要是硫化氫）通常被認為是牛乳蒸煮味的來源。毫無疑問，它產生于（或部分產生于）脂肪球膜蛋白或β-乳球蛋白的半胱氨酸殘基的β-消去反應。不同乳制品加熱時，揮發性硫化物的生成量不同，稀奶油高于脫脂乳，每升牛乳中富含β-乳球蛋白約3.2g，脂肪球膜蛋白的半胱氨酸殘基則要少得多，因此釋放時揮發性硫僅為總巰基和二硫化物的一小部分。

當溫度超過75℃，乳蛋白（主要是β-乳球蛋白）的Cys和Met兩種含硫氨基酸巰基被裂解，生成H₂S、硫醇和硫化物等，使得牛乳產生了蒸煮味。熱處理產生的HS—濃度和蒸煮味的程度主要與加熱溫度、熱變性的深度有關，90℃時達到最大值。隨著加熱溫度升高和時間延長，牛乳中的Cys和Met含量會有輕微下降，經測定UHT乳中HS—的濃度是0.7μmol/L，間接加熱殺菌比直接加熱殺菌的蒸煮味更嚴重；巴氏消毒牛乳通常沒有蒸煮味。幾天后自由巰基因被氧化而含量下降，所以蒸煮味也變淡，這就是UHT牛乳放置15d左右風味達到最佳的原因。為了減少蒸煮味，可以在UHT乳中添加L-Cys，這樣可以降低巰基濃度；也可在牛乳中添加巰基氧化酶。

如表2-1反應9所示，巰基還可能與脫氫丙氨酸殘基反應形成羊毛硫氨酸鉸鏈，但分析表明，對1%β-乳球蛋白的溶液，pH6.9，97℃下加熱80min，僅有少量羊毛硫氨酸生成。然而115℃，27h加熱1g“干”乳清蛋白和115℃，54h加熱同樣質量的“干”乳清蛋白可分別產生2.7mg和12.0mg的羊毛硫氨酸。

（三）酪蛋白和乳清蛋白的相互作用

我們知道90℃的熱處理使乳清蛋白變性并和酪蛋白聚合，這種結合的程度和類型依賴熱處理的程度，所發生的反應包括κ-酪蛋白的參與及二硫鍵互換反應的發生。

在β-乳球蛋白缺乏的情況下，α-乳白蛋白很難在加熱過程中和酪蛋白膠束結合。變性乳清蛋白在90～140℃、pH＜6.7的乳中絡合于膠體表面，包括絡合于κ-酪蛋白上，在較高的pH值如pH7.3時加熱，乳清蛋白不和酪蛋白結合，膠束大部分解離。濃縮乳清蛋白和酪蛋白膠束的結合少于非濃縮乳。pH6.55、120℃加熱后50%的乳清蛋白還將留在乳清中，當pH6.85時則上升為75%，乳清相中的乳清蛋白通過二硫鍵和κ-酪蛋白形成絡合物。

一般認為，當共同加熱或將κ-酪蛋白加入預熱的β-乳球蛋白中時，它們通過巰基-二硫鍵相互變換反應。但還不能確定，這樣的復合物是否是在加熱中形成的，這種復合物的分離狀態和復合體系中是否相似。毫無疑問，加熱牛奶時β-乳球蛋白和酪蛋白之間存在一些反應，這些反應顯著影響了牛奶的熱穩定性和凝乳酶凝集。

β-乳球蛋白和α-乳白蛋白改變酪蛋白鹽體系的熱穩定性的機制尚未建立。開始認為β-乳球蛋白有穩定作用，但有一些人認為，在pH6.9時β-乳球蛋白使酪蛋白不穩定，因此HCT-pH曲線上有最大值-最小值。β-乳球蛋白對酪蛋白熱穩定性的影響依賴于磷酸鈣的濃度，這也許是因為β-乳球蛋白-酪蛋白復合物中鈣沉淀，與分離的β-乳球蛋白的情況類似。

牛乳加熱到70℃以上時，β-乳球蛋白易與κ-酪蛋白和α_s2-酪蛋白反應，然后與酪蛋白膠束結合。pH值大于6.6時，β-乳球蛋白與非膠束型酪蛋白部分結合，隨pH值升高，結合變小，pH值大于7.0時，實際上已不存在結合。α-乳白蛋白、乳清蛋白、免疫球蛋白也與酪蛋白結合，上述反應能明顯影響酪蛋白膠束的特性；若牛乳熱處理中酪蛋白發生沉淀（如在等電點附近），則正常情況下沉淀中還包含有熱變性乳清蛋白，這一特性已被用來評價牛乳熱處理程度。當加熱乳清蛋白時，變性乳清蛋白在一定程度上發生聚集，pH6.6以上，聚集較少；低pH值情況下，它們的穩定性下降，pH4.5附近時，下降到最小值。提高pH值后（pH6.8）變性的乳清蛋白-酪蛋白膠束復合物表現出解離，這可能與HCT-pH曲線上的最大值-最小值現象有關。

在加熱過程中α-乳白蛋白和κ-酪蛋白不發生相互反應，而是與β-乳球蛋白反應，并且這種復合物可以與κ-酪蛋白反應。對于α-乳白蛋白是否改變酪蛋白膠束懸浮液的HCT-pH曲線的問題，有不同的看法，尚無定論。

（四）牛乳蛋白質熱變性對牛乳的影響

牛乳受熱變性對牛乳質量的影響不一定就是負面的，具體的影響可以總結如下。

1.易于消化

實驗發現，胰蛋白酶、胃蛋白酶和胰液素更容易黏附在變性蛋白上。牛乳蛋白質經熱變性后結構變得松散，所以變性牛乳容易被酶降解，比天然牛乳更易消化，UHT滅菌和巴氏消毒乳蛋白質比生奶更有利用價值。只有強烈的熱處理（120℃、60min）能減少胰蛋白酶的水解能力，但能大大提高胃蛋白酶的水解率。另外，熱變性蛋白質在胃內被胃酸水解后形成的顆粒分散能力非常好，這也有利于酶的黏附、降解。熱處理會滅活胰蛋白酶抑制劑，反過來就能促進胰蛋白酶的活性，這也能促進乳蛋白的降解和消化。

嬰幼兒飲用UHT乳后出現消化不良的比例很少，主要也是因為牛乳的熱變性蛋白在胃酸作用下特別容易分散。當牛乳的受熱強度達到120℃、80min時會影響乳蛋白的消化性，但這種加熱強度在乳品加工中幾乎不會出現。

2.不利影響

即使是UHT殺菌，乳蛋白性質變化也幾乎不會影響它的生物價值，實驗發現小老鼠在利用UHT乳、巴氏消毒牛乳和滅菌乳的蛋白質方面幾乎沒有差別。UHT乳的蛋白質平均得率（老鼠體內氮占體重的比例增加與膳食氮的攝入量之間的關系）與生乳的相同，都是96%～97%。如果測定氨基酸的生理活性，可以發現UHT乳中活性是生乳的95%～100%。嬰幼兒的膳食實驗證明，不同殺菌工藝的牛乳對它們營養沒有顯著差異。只有當使用極端熱處理能改變牛乳蛋白質的生物活性，但在牛乳加工時從來不需要使用這些極端熱處理。

堿性添加下對牛乳加熱，乳蛋白會發生化學變化，形成賴氨酸-丙氨酸（lysinoalanine，LAL），將賴氨酸由L型轉化為D型。當老鼠食用含2000mg/kg結合蛋白質的LAL食物，它們的腎將會受到傷害，產生腎細胞腫大吞噬作用（nephromegalocytosis）；而LAL對小老鼠的毒性很低，對猴子等其他動物甚至沒有毒性。因此可以推測LAL對人體沒有毒性，所以即使在家庭飲食中攝入了LAL也不會對人體產生任何毒副作用。當膳食中含20%的堿處理大豆蛋白，老鼠就會患腎細胞腫大吞噬作用；而當改用堿處理乳白蛋白，即使LAL含量再高老鼠也只是患輕微的腎細胞腫大吞噬作用。若將8%～10%未處理乳白蛋白加到含10%～12%經堿處理的大豆蛋白或乳清蛋白中，老鼠食用含1800～2500mg/kg的LAL也不會引起腎細胞腫大吞噬作用和骨細胞吞噬作用（cariomegalocytosis）。

牛乳和牛乳制品、嬰兒食品都不含LAL或含量極少，只有加工時的熱處理強度過高時才會引起LAL含量偏高。酪蛋白酸和堿處理產生的酪蛋白-乳清蛋白聚合沉淀物都與LAL含量有關，但控制加工過程中的溫度和pH值等參數能減少LAL生成量。雖然LAL自身對人體沒有毒副作用，但由于賴氨酸的ε-NH^＋₃（即6碳位的-NH^＋₃）參與它的形成反應，所以會導致蛋白質變性；同時發現Cys和Ser含量下降、蛋白質水解速度減緩。所以LAL的升高是蛋白質受熱損失的重要指標。

二、乳其他成分的變化

（一）加熱時乳脂肪的變化

乳脂肪的97%～98%是甘油三酯，決定乳脂肪的主要理化性質，其他組分還包括二甘酯、單甘酯、自由脂肪酸、自由固醇和磷脂等。加熱時脂肪球發生冷凝集、脂肪結晶、磷酸酯（尤其是酪蛋白磷酸酯）的水解等。部分有機磷酸酯甚至磷脂在高溫下（100℃以上）也會發生分解。溫度高于60℃時，形成游離巰基和硫氫化合物。脂肪球膜發生變化，如鈣含量的上升等。甘油三酯在高溫（120℃以上）時進行酯交換反應，該反應受二甘酯、單甘酯的存在情況的影響；該溫度條件下，一些極性脂肪也發生反應。加熱還形成了一些來源于脂肪的內酯和甲基酮的形成。牛乳經加熱后游離脂肪酸減少。據報道，游離脂肪酸加熱后的平均損失量是72.8℃，16s為13.1%；62.8℃，30min是15.6%；85℃，30min達24.4%。

總體而言，乳制品工業上使用的殺菌對牛乳的脂肪沒有不利影響，脂肪和油經過高溫加熱不會對健康有害，這是因為溫度對脂肪的光化學氧化影響甚微。高溫下牛乳中會形成過氧化物、過氧化氫物、羰基化合物和羥基脂肪酸的物質，而且如果有空氣存在會加速不飽和脂肪酸和膽固醇的過氧化反應，但這些產物對健康沒有不利影響。只有極端加熱（200℃、20h）才會產生對人體有害的聚合產物，但這種加熱強度在乳制品加工中不會出現。

牛乳受熱后羥基酸會轉化為內酯，后者會影響牛乳的感官特性。內酯存在于所有加過熱的牛乳和乳制品中，有時它們的含量非常低，對產品的風味只有輕微的影響。另外，牛乳受熱后還能形成乙醛和甲基酮等羰基化合物，它們也會影響牛乳的風味。UHT牛乳比巴氏消毒牛乳含的內酯和羰基化合物更多，例如，甲基酮占脂肪的含量在生鮮牛乳、巴氏消毒牛乳和UHT牛乳中分別是10nmol/g、12nmol/g和21nmol/g，而在傳統殺菌方法加工的牛乳中更是高達104nmol/g。

多數不飽和脂肪酸和亞油酸等必需脂肪酸（essential fatty acid，EFA）在高溫下性質穩定，例如只有在180℃下保溫1h才能測到亞油酸的降解產物，至今尚沒有在UHT牛乳和滅菌乳發現必需脂肪酸的降解產物。高溫會引起磷脂變化，會增加自由脂肪酸含量。

高溫會抑制脂肪的自發氧化。脂肪酸及其殘基的雙鍵有可能被氧化，有的氧化產物會影響產品的風味，如產生油膩、腥味、金屬味和木屑味等異味。

能極大促進乳脂肪自發氧化能力的幾種試劑是游離O₂、超氧自由基（O^－₂·）和羥基（OH·）。

①Cu能促進O₂的產生，而巴氏消毒能刺激—SH特別是自由H₂S的生成，后者與Cu^2＋結合形成CuS沉淀；

②Maillard反應產物是抗氧化劑；

③加熱可以破壞超氧化物歧化酶（EC 1.15.1.1） （一種強抗氧化劑，又稱SOD）的活性；

④中溫加熱能促進脂肪的自發氧化，這有可能是因為Cu增加。

UHT牛乳在保存過程中，脂肪會發生自發氧化反應，而且這種反應隨著牛乳中溶解氧的增加、貯存溫度升高而加劇，這種氧化作用會破壞牛乳風味。Dunkley和Franke發現牛乳貯存溫度由0℃到4℃，再到8℃，牛乳的風味在減弱，硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）含量下降。

（二）加熱時乳中糖類的變化

通常牛乳在熱處理過程中，其所含的乳糖成分并不會有太大的改變。但是強烈的加熱處理，則會造成乳糖的分解，尤其以濃縮乳最為明顯。乳糖加熱后發生了一系列變化，生成有機酸（主要是甲酸）和乳果糖等，上述變化在溫度高于100℃尤為明顯。牛乳在加熱過程中，酸形成的速度隨牛乳中乳糖含量的增加而呈比例地增加。所形成的酸類包括甲酸、乳酸、丙酮酸、丙酸、丁酸等。

牛乳因加熱所導致的乳糖分解產生的化合物包括甲基二醛、丙酸醇、落葉松皮素、5-羥基-2-甲基糖醛及糖醇等。

（三）加熱時乳中維生素的變化

牛乳經加熱后，其營養價值因維生素的損失而降低。表2-2為各種熱處理對維生素損失的影響。

從表2-2中可以看出，維生素A、維生素B₂、維生素D、尼克酸及生物素對熱是穩定的，在一般加熱處理中不會受到多少損失。維生素B₁、維生素B₁₂、維生素C等在加熱處理中會受到損失，但是在無氧條件下加熱，就能減少其損失。

1.維生素A

由于維生素A是脂溶性的，脂肪對它有保護作用，全脂牛乳加熱和保存過程中它基本是穩定的，但脫脂牛乳（0.04%脂肪）經UHT殺菌可以造成40%的損失。含脂率為0.5%的牛乳在5℃保存3個月，而含脂率為0.15%的牛乳在26℃保存8d（Lau，1986），維生素A的損失都是50%。

此外，不同包裝容量對維生素A的影響也有差異，含脂率2%巧克力牛乳在20℃保存28周后，1L紙盒包裝的維生素A損失36%，而250mL包裝的損失25%。Gaylord（1986）發現提高牛乳的非脂乳固體也能減少維生素A的損失。

低脂牛乳（2%脂肪）和全脂牛乳經光照后保存在4℃環境，維生素A損失呈一級反應。Murphy等測定了7～10℃時脫脂牛乳中維生素A在玻璃、塑料或紙盒和暴露在熒光中的降解速度，發現降解50%所需時間分別是41h、61h和1004h。

2.維生素C

牛乳的維生素C基本不能起到營養作用，但能保護葉酸。所有研究都證明無論是加熱還是貯存，牛乳的維生素C都損失嚴重，這一方面是由于加熱會導致維生素C損失；另一方面在保存過程中由于O₂的存在導致維生素C被氧化脫氫，而且牛乳初始O₂含量越高，維生素C損失越嚴重。加熱對牛乳進行脫氣，可將O₂的含量降至0.05%，這樣牛乳中的維生素C在前兩周下降很快，然后就非常緩慢。牛乳貯存在隔絕空氣的塑料或涂蠟紙盒，維生素C的損失速度將比貯存在玻璃的更快。

Nagy（1980）的研究表明貯存溫度越高，維生素C損失速度越快。

3.葉酸

Thomas等（1975）的研究表明氧氣含量適中（5.2×10^-6）或較低（1×10^-6）時，葉酸在熱加工過程中的損失很少；若氧氣含量達到8.4×10^-6，葉酸將損失18%；如果繼續在23℃的黑暗環境中貯存28d，葉酸的含量將快速降至6%以下。

三、乳pH值的變化

牛乳加熱后，滴定酸度上升，pH值下降。滴定酸度的上升是眾多因素綜合作用的結果，但主要來源還是乳糖分解產酸。

在較高溫度的熱處理時，pH值從6.7開始下降，直至凝集時的pH值為5.5～6.0。下列因素分別對pH值下降貢獻了30%、20%和50%：①由于H^＋釋放使pH值下降，這是由于CaHPO₄、Ca（H₂PO₄）₂會形成Ca₃（PO₄）₂沉淀而導致H^＋的釋放；②有機磷酸酯鍵（酪蛋白中）水解和磷酸鈣的沉淀；③乳糖熱斷裂形成甲酸等有機酸。

圖2-4顯示了乳的熱凝固時間依賴于pH值的實例，它表明在不同的pH值下決定凝集速度的是不同的反應，也顯示出不同的乳對pH值的依賴性不同。絕大部分的牛乳是A型，一些是B型。混合乳一般為A型，但其曲線的形狀會顯示出比圖2-4所示的更多的變化。

圖2-4所示的pH值是加熱前室溫下pH值的實例，在高溫下pH值將會低得多。但這主要是水的離解增加的結果，并且較低pH值并非意味著更酸的環境。在高溫下無定形的三磷酸鈣沉淀，及由此引起的質子釋放，可促使pH值進一步降低，更進一步地在加熱過程中產生酸。凝固時的pH值（在室溫下測定）將大大降低，pH值越低，凝固所需的時間越長，溫度要求也越高。pH值變化速度依賴于最初pH值和O₂的變化。因乳糖產酸需要O₂，加熱過程中酸的產生速度在乳（非濃縮乳）的熱凝固中是一個非常重要的因素。凝固時的pH值總是低的（＜6.2，于室溫下測定）。加熱過程中加入堿，維持其最初pH值，可防止熱凝固，這種效果甚至可以在加熱后維持幾小時。熱凝固的表觀活化能通常與產酸活化能相等。

四、褐變反應

牛乳經長時間高溫加熱則發生褐變反應。這類反應屬于非酶褐變，主要是酪蛋白的末端氨基酸——賴氨酸的游離氨基與乳糖的羰基發生反應（美拉德反應，Maillard），其次是乳糖的焦糖化反應。該反應涉及酸、堿催化的烯醇化反應和脫水反應。美拉德反應中糖的降解途徑與焦糖化過程很相似，所不同的是美拉德反應中加熱溫度更溫和，pH值接近中性。美拉德反應途徑在乳與乳制品中是最重要的反應之一。

美拉德反應低溫下也能進行，但溫度升高，美拉德反應加速。加熱牛乳時，一開始顏色變白，隨后隨加熱溫度的上升，逐漸產生褐色。牛奶加熱過程中首先出現“蒸煮味”，主要來自巰基和硫氫化合物；而后出現的殺菌牛乳的風味，是美拉德反應及其他反應的結果。牛乳的酸度也影響美拉德反應的發生，褐變的臨界pH值為6.0～7.6。另外，牛乳中微量尿素的存在也被認為是反應的重要原因。

乳糖在高溫下焦糖化而形成的褐變，其反應的程度隨溫度和酸度而異，溫度與pH值越高，褐變越嚴重。此外，糖的還原性越強，褐變也越嚴重。因此，使用轉化糖含量多的蔗糖或混用多量葡萄糖時，會產生嚴重的褐變。

褐變反應可以被硫氫基、亞硫酸氫鈉、二氧化硫、甲醛或添加0.01%游離半胱氨酸所抑制。在實際應用中，褐變反應可利用減少加熱處理過程的時間和溫度、減少干燥制品的水分含量及控制制品的貯存溫度及時間等方法來防止。

美拉德反應中，實際上真正的褐變發生之前，產品風味已受到嚴重影響，因此研究美拉德反應的前一階段（褐色產生之前）具有非常重要的意義。乳制品褐變反應的證實或反應進程的監測可從以下幾個方面入手：反應產物、褐色素、熒光強度、異味、pH≤6.5時測得的還原能力以及賴氨酸減少量。美拉德反應的許多化合物已得到分離與鑒定，如5-羥甲基糠醛、糠醛、麥芽酚、丙酮醇、2-酮基丙醛、乙醛和甲酸、乙酸、丙酸、丁酸以及乳酸。

5-羥甲基糠醛可通過比色反應測定，已被用于監測美拉德反應的一系列過程，麥芽醛及其他化合物對乳制品的風味有貢獻。除某些特殊需要外，大多數乳制品中不希望出現褐色。褐變程度可通過測定產物的反射比得到，部分產物吸收紫外線，反射熒光，這些物質可用醚予以抽提，因此它區別于核黃素。

乳制品美拉德反應主要受pH值、時間、溫度和水分活度的影響。在一定范圍內隨pH值上升，褐變反應加速，但由于反應中有酸生成，因此在一定程度上還有自我抑制作用。褐變反應速率隨固形物濃度的增加而增加，當水分活度達到0.6時，達到最大值。單糖比雙糖更易與氨基化合物反應，因此乳糖經乳糖酶水解后更易于褐變反應的發生。

現在研究較多的褐變反應多是發生在pH值上限的140℃以上的褐變。圖2-5顯示的是牛奶在pH6.7和pH7.2時加熱到140℃染色力的下降，這可假定它反映了與乳糖反應后賴氨酸的未利用率。在pH6.7和pH7.2加熱20min后，分別有接近15%和25%的賴氨酸殘基表現為不能利用。蛋白質賴氨酰殘基的ε-氨基參與羰基的美拉德反應，它也能與脫氫丙氨酸和羧基側鏈形成“鉸鏈”（如表2-1反應10、11、12）。這些反應僅在激烈的加熱條件下方能發生。在112℃下加熱“干”酪蛋白或乳清蛋白還可產生異肽、ε-N（β-天門冬氨酸）賴氨酸和ε-N（γ-谷氨酰基）賴氨酸。堿性條件下加熱還能生成賴氨酰丙氨酸。牛乳殺菌（包括UHT）過程中，每千克蛋白質可產生100～500mg賴氨酰丙氨酸，某些蛋白制品或衍生產品中賴氨酰丙氨酸的含量更高，這一點已引起專家的注意，因為高劑量的賴氨酰丙氨酸對鼠試驗具有毒性，但同樣的劑量對人體卻基本上不會產生有害影響。

賴氨酸的ε-末端似乎與一些牛奶的聚集反應有關：賴氨酸的變性阻止了凝乳聚集的二級階段；乙醛延長了HCT的原因可能是通過與賴氨酸的反應；褐變反應與UHT牛奶的老化膠凝有關。因此可以認為在熱穩定性中美拉德反應有一定作用。但對一個添加了5%的乳糖的樣品與添加了5%蔗糖的無乳糖牛奶樣品，在加熱后分離酪蛋白的鈣敏感性沒有顯著不同。

向牛奶中添加尿素而促進褐變反應，其原因可能是尿素和乳糖的反應或它們產物的降解導致的。這樣尿素可能對蛋白質的氨基有保護作用，但是這種保護作用并不在尿素對牛奶的穩定作用中起顯著作用。

加熱會使酶的結構發生變化，造成酶活性喪失。一般而言，溫度高于50℃時酶開始鈍化，但是不同的酶的鈍化溫度不同。解脂酶經80～85℃的高溫短時間或超高溫處理失活。磷酸酶經62.8℃，30min或72℃，15s加熱后會鈍化，可用這個性質來檢驗低溫巴氏殺菌法對殺菌牛乳的殺菌處理是否充分。過氧化氫酶經75℃，25min加熱可全部鈍化。過氧化氫酶的鈍化溫度和時間為70℃，150min；75℃，25min和80℃，2.5s。

五、無機物的影響

乳的熱處理減少了可溶性磷酸鹽、可溶性鈣、離子鈣的量，其程度依賴于熱處理的時間和溫度。如在60～83℃加熱時，可溶性鈣減少0.4%～9.8%，可溶性磷減少0.8%～9.5%。這是由于可溶性的鈣和磷形成Ca₃（PO₄）₂沉淀。溶解鈣和磷酸鹽結合為膠體磷酸鈣沉淀，也可通過和酪蛋白膠束的結合防止其沉淀。若加熱溫度＜110℃，這些沉淀物會重新溶解；若加熱溫度＞110℃，這種變化是不可逆的。加熱對單價離子如Na^＋、K^＋、Cl^－沒有影響，對檸檬酸鹽的影響尚不清楚。

利用一個中空纖維超濾與不銹鋼熱交換器結合的方法在不同溫度下制取牛奶滲透物。牛奶樣品先調至4℃，然后在超濾前分別加熱到20℃、40℃、60℃、80℃、85℃或90℃。測定滲透物樣品中Ca、P、Mg、Na、K和檸檬酸根的濃度。結果發現當溫度升高時，Ca和P的含量下降，Mg和檸檬酸根含量也略有下降，而Na和K的含量沒有受到影響。在本研究中獲得了一個時間-濃度關系圖（圖2-6和圖2-7）。

在保溫的開始階段濃度有一個明顯下降，然后反應較為緩慢。加熱過程中伴隨著磷酸二鈣和磷酸三鈣的沉淀。

把滲透物冷卻到室溫后測定pH值，獲得pH曲線。pH曲線和Ca、P曲線的相似性表明磷酸鈣沉淀是加熱的牛奶pH值下降的主要原因。根據Pyne報道，磷酸鈣沉淀變化是在適度加熱的牛奶中唯一發現的可意識到的鹽平衡變化，盡管當溫度上升時與酪蛋白結合的鈣的變化可能導致pH值的下降，檸檬酸鈣沉淀也將導致一定程度上的pH值下降。

關于檸檬酸鹽沉淀的研究尚存在不同意見。Evenhuis和De Vries（1957）、Davies和White（1959）等人的研究都不以此溫度下的滲透物和透析物為樣品進行，這可能導致了一些反向的檸檬酸鈣沉淀發生。Boulet和Marier報道說室溫下的脫脂牛奶被檸檬酸鈣飽和，但提高溫度并不能使這種鹽沉淀。在這種情況下我們必須考慮到他們關于95℃下檸檬酸鈣的溶解性計算時所用的是室溫下的解離常數。Lyster（1979）關于牛奶中離子平衡的計算也表明40℃下pH4.6和pH6.5時可能存在檸檬酸鈣沉淀。Pouliot等人的研究也表明當將一個20℃時pH7.0、離子強度0.8的檸檬酸鈣的飽和溶液加熱到95℃時也發生沉淀。

關于無定形的磷酸鈣或三聚磷酸鈣具有熱致沉淀的假設并不能根據現在對于沉淀物質中Ca/P比率的研究加以證實。這個比率約為1.0，與加熱導致二聚磷酸鈣沉淀的比率一致。但在實驗中，時間-Ca、P濃度變化的曲線不是一個典型的成核過程，并沒有促進二聚磷酸鈣的沉淀。根據在室溫下的其他研究發現，二聚磷酸鈣的典型成核過程只存在于牛奶的滲透液中而不是在起始的牛奶中。Edmondson（1956）等人發現只有在88℃加熱牛奶15min之前加入Na₂HPO₄才產生二聚磷酸鈣的沉淀。還不清楚沉淀是由膠束態的組分獨立發生還是由膠束態的磷酸鈣結構直接變為新的沉淀組分。Holt（1982）已經指出，室溫下牛奶滲透液對于二聚磷酸鹽而言是飽和的。因此認為沉淀可能是由于溫度升高。

Pouliot等（1989）認為熱致鹽類變化是一種典型的二級變化。如果認為Ca、P、Mg和pH值在開始發生沉淀的最初時間內發生第一次沉淀，則二級反應還包括更慢的反應，并與溫度無關。

但是必須考慮到所謂的二級反應可能是由于一級反應達到其平衡點后而變緩慢導致的。檸檬酸鹽在整個過程中的變化表明這是一個相對較慢的過程。因此，這種緩慢的可逆的起始檸檬酸鹽沉淀可能是起始pH值和Ca降低的直接結果，它增加了檸檬酸鹽沉淀的溶解性。檸檬酸鹽的反向也因P的反向而滯后，這說明在兩個鈣鹽和它們的反向之間的反應應該是一個再平衡的過程。Rose和Tessier（1959）的研究也提出在加熱的牛奶中存在鹽類的二級沉淀。他們發現在加熱的起始5min內存在可溶性鹽類的降低，在接下來的20min內只有很小的變化。

事實上，第二步反應與熱致磷酸鈣沉淀反向轉化為Ca/P比率更高的更偏堿性鹽相關，這樣也解釋了在保溫時間為30～120min內P的微小變化。Boulet（1960）建立了一種模型體系來證明磷酸鈣沉淀以兩步進行，包括一個較快的凝膠化的沉淀以及后繼的由更偏堿性的組分形成粒狀鹽而導致的誘導過程。這表明粒狀沉淀的形成是由于二聚磷酸鈣快速反向轉化為更堿性成分而導致的。Schmidt和Both（1987）的研究證實若一個適度超飽和溶液50℃時pH＞6.14，其中二聚磷酸鈣沉淀后便轉化為八聚體。這個結論只適用于一個不含蛋白質殘基的模型體系中。我們所做的P和Ca曲線的變形也可以表明這種熱致的磷酸鈣鹽的變化。此外，pH值隨時間的變化也反映了磷酸根的離子化變化——在產生熱致鹽沉淀時減少。而在檸檬酸鹽和磷酸鹽之間的反應并不影響pH值的變化，因為這兩種鹽的沉淀對pH值的變化有相同的影響。

將牛奶加熱到85℃保溫40min后分別冷卻到4℃、20℃、40℃和60℃后測定牛奶中鹽的變化。時間-濃度曲線表明Ca、P和pH值變化是二級反應。85℃保溫40min的熱處理效果加大了第二步反應的變化。由于其他成分（Mg和檸檬酸鹽）的影響使結果具有多樣性，只能計算出Ca和P的可逆性，分別有90%～95%和93%～99%依賴于冷卻溫度。Pouliot（1989）還討論了熱致變化的可逆性，特別是冷卻可能導致的磷酸鈣和檸檬酸鈣沉淀的分解平衡。

85℃加熱后在4℃保溫1440min后有90%～95%的鈣沉淀被重新回收，這與Rose和Tessier（1959）的結果一致，即4℃冷卻后有75%～90%的熱沉淀的Ca和P重新分散；也與Hilgeman和Jenness（1951）的結果沒有很大不同，即4℃冷卻48h后100%的熱致Ca和P變化發生反向變化。

表2-3的數據顯示Ca的可逆性大于P，因為此時的數據大于加熱時獲得的數據，接近于1.00。這似乎與從表2-4中計算的數據相反。一個可能的解釋也許是冷卻后與酪蛋白結合的Ca及一些熱致沉淀的磷酸鈣重新分散，因此可溶性Ca的水平又恢復了。較高的冷卻溫度獲得較高的（Ca+Mg）/P值，這可能是由于較低的pH值促進了已結合的Ca的分散。生乳組分從膠態轉變為可溶態的組分。

與時間相關的Ca、P和pH曲線表明鹽沉淀的可逆性依賴于冷卻溫度，因為每一個冷卻溫度都有不同的平衡值。表2-4的數據進一步證實了可逆的變化依賴于溫度（Pouliot et al.，1989b）。沒有像在加熱條件下各離子變化那樣的尖銳曲線，一般而言起始濃度增長不像加熱時有相應的下降。與加熱反應相比，對濃度變化程度而言，第二步的變化更為重要。如果認為體系是完全可逆的，則不存在這種不同。從膠束相中釋放出鹽似乎是由不同的機制所控制的。

現在還不能確定觀察到的檸檬酸根的可逆性和多樣性是與結合產生熱沉淀的磷酸鈣相關，還是因為沉淀的檸檬酸鈣很低的溶解性而造成的。Boulet（1996）建議在堿性條件下沉淀的牛奶中膠束態的磷酸鈣可能與一些檸檬酸根結合。另外的研究（Boulet and Marier，1960）顯示在低的離子強度下檸檬酸鈣顯示出較低的溶解性，Pouliot（1989）也證實至少與檸檬酸鹽沉淀的低可逆性有部分的聯系。

為了解釋在冷卻過程中發生的現象，我們必須考慮在形成熱致沉淀鹽形成過程中相關的可能發生的變化。如果我們假設沉淀的磷酸鈣在加熱過程中轉化為一個更堿性的形式，還不甚清楚是否在冷卻過程中存在從沉淀的物質或酪蛋白膠束自身的鈣中解離的現象。但是由于在冷卻過程中發生的反應與在加熱過程中的反應相同，都是二級反應，所以自身的磷酸鈣解離的可能性較小。

得到的數據表明加熱后膠束態的磷酸鈣組分間存在緩慢的再平衡過程，這樣一個在磷酸鈣和檸檬酸鹽之間的復雜的平衡過程控制了冷卻過程的可逆性。但需要對牛奶體系中磷酸鈣的沉淀和解離過程加以進一步的實驗研究。

六、乳的熱穩定性的測試方法

乳的熱穩定性是指乳在滅菌（或殺菌）處理時抵抗凝乳的能力，它通常用乳放置于一定溫度油浴的容器中至凝乳生成的時間來表示，凝乳的生成通常用絮凝、膠凝或沉淀的變化來標記，油浴的溫度常用120℃、130℃、140℃的固定溫度。最常用的評定牛乳穩定性的方法如下：把1～2mL乳樣封于玻璃管中，放于油浴中，一般標準乳用140℃，濃縮乳用120℃，固定在平臺上的玻璃管應以一定的速度搖動，直至流動乳中有絮凝蛋白產生，這種方法常被稱為“主觀方法”（subjective method），它受實驗溫度、攪拌速度、玻璃管的填充量和傾斜角的影響，來自各方面的數據比較性較差。

White和Davies（1966）報道了以蛋白沉淀為基礎的熱穩定性的測定方法。他們通過測定經熱處理后以低離心力離心沉淀蛋白質的百分率來確定穩定性，若沉淀量有迅速增加說明已經絮凝，我們稱為“客觀方法”，其終點較主觀方法準確，缺點是費時和不能具體應用。此后許多科學家試圖應用酒精實驗、色澤實驗、黏度變化等測定熱穩定性，均未得出令人滿意的結果，與油浴結果的差距較大。

Foissy和Kreifel（1984）開發了一種應用電磁系統客觀自動測定熱穩定性的方法，這種方法和油浴法呈很好的相關性。Dewit等人（1986）設計了一種稱為Klaro圖的連接計算機裝置，也可應用玻璃管式黏度計，觀察加熱過程中流經玻璃球的時間來衡量熱穩定性，若黏度迅速上升，說明此時為絮凝點。

Helmut等發展了一種自動檢測奶粉溶液熱凝結時間的方法。在這種裝置中一個鉻盤放在一個由磁鐵驅動的鐵活塞上，在控制下通過一個盛有少量牛奶樣品的圓筒。當牛奶開始凝結時，圓筒內表面和金屬活塞間的電阻大于旋轉磁鐵的磁力而使磁鐵線圈偏離活塞中軸，從而導致線圈電流的瞬間變化，擴大后可用來停止一個數顯時鐘。本節主要介紹一些乳熱穩定性檢測的常規方法。

（一）煮沸試驗

煮沸試驗是牛乳新鮮度試驗的一種。具體檢驗方法：取約10mL牛乳，放入試管中，置于沸水浴中5min，取出觀察管壁有無絮片出現或發生凝固現象。如產生絮片或發生凝固，表示牛乳已不新鮮，酸度大于26°T。

（二）酒精試驗

20世紀80年代以來，人們對乳的酒精穩定性的研究形成高潮，目前來說，乳的酒精穩定性主要有以下三方面的成果：

①目前已有了關于酒精應用于乳的最深入最完整的理解；

②酒精穩定性實驗用于延長稀奶油酒（cream liqueur）的貨架期；

③酪蛋白的酒精穩定性對研究“毛發狀膠體”的空間穩定性方面有支持和啟迪意義。

1.酒精穩定性的測試

一個世紀前已有乳的酒精穩定性的測試，尤其在西歐，它作為零售乳制品品質的衡量標準。將70%（體積分數）的酒精與等體積的乳混合時，若出現沉淀說明原料乳質量較差不能接受。20世紀30年代酒精試驗用于測定乳是否變酸、混合初乳是否是乳房炎乳。20世紀上半葉人們以酒精試驗和滴定酸度作為無菌濃縮產品原料乳適應性的標志，開始時結果是令人滿意的，Dehlberg和Garner（1921）認為酒精試驗對于測定濃縮產品原料乳質量是具有實際意義和可信的，但這種期望沒有變成現實。Ramsdell等人（1931）認為酒精試驗不能用于滅菌產品乳分級的判定標準。White和Davies（1956）在乳熱穩定性實驗中認為凝乳時間和乳對酒精敏感性之間沒有必然關系，他們也承認沒有發現二者的關系部分原因是因為忽視了兩種凝乳現象的機制。Samuelsson等人（1962）發現酒精穩定性和UHT乳的沉淀程度相關。Zadow等人（1983）注意到酒精誘導和UHT誘導不穩定性的關系，尤其是關于pH值、Ca^2＋的影響。

2.酒精穩定性和酪蛋白結構

（1）酒精和酪蛋白膠體空間穩定性的關系

若溶劑環境不利，蛋白質和其他多聚體的構象變化，分子的有效體積減小，這種構象的“崩塌”形態常引起蛋白質分子的凝聚。酒精作用于膠體粒子產生絮凝可能緣于對酪蛋白有保護作用的κ-酪蛋白的解離并破壞了它的空間穩定性。Horne（1984）測定了酪蛋白膠體的流體力學半徑，達到凝集濃度的酒精添加使其半徑減小了約10nm，但隨著酒精濃度通過臨界值，流體力學半徑通過最小值而迅速膨脹，這是由凝集引起的。

酪蛋白膠體半徑下降是其均勻球體收縮或其“毛發狀”外層構象變化的結果，表面現象的變化類似于凝乳酶誘導凝集的變化，無酒精存在的情況下添加凝乳酶半徑下降約5nm，無凝乳酶當16%（體積分數）的酒精存在時，膠體半徑下降約8nm，再添加凝乳酶于其中，在酶誘導凝集前膠體半徑沒有變化。

在溶液中酪蛋白的獨特折疊結構使其呈穩定性，這主要緣于疏水相互作用、氫鍵和靜電排斥，這些因素均受有機溶劑的影響，溶劑的存在引起蛋白質變性、酶反應抑制和乳的穩定性變化及凝集。Leighton（1928）認為酒精的乳凝集緣于它對蛋白質的變性作用，Herskovits（1970）證明酒精有效性是因為酒精增加，蛋白質鏈長度增加或烴量增加，烴化合物的支鏈傾向于減少這種有效性，隨著烴基量增加也是如此。Horne和Parker（1981）用酒精作為乳的沉淀劑和Herskovits的結果是一致的，當酒精穩定性值用酒精、水混合物介電常數的函數表示時，可得到一個普遍適用的沉淀曲線，作為pH值的函數或固定pH值下鈣添加量的函數也能獲得沉淀曲線，據此可以斷定酪蛋白的穩定性是由介質的介電常數決定的，但Herskovits的結果表明，酒精變性濃度和混合物介電常數間應是一個區域值而非單一值，說明蛋白質變性程度不能簡單地看做介電常數的函數，應包括蛋白質和酒精間的多種親和作用。

酒精明顯減少了混合物的介電常數使其達到誘導沉淀的臨界值，這反映出膠體粒子間的電極電勢即靜電排斥的重要性，Horne和Parker認為不同的溶解性鈣濃度的影響主要通過影響膠體電荷來體現，Ca^2＋增加，酪蛋白結合水平增加，膠體間電荷排斥減弱，穩定性下降；反之，Ca^2＋降低，結合降低，穩定性升高，按照這種思路，酪蛋白的化學改性若增加電荷，則有助于乳的酒精穩定性。

乳酪蛋白酒精變性時“毛發狀”κ-酪蛋白是“崩塌”而非脫附，膠體粒子的半徑變化非常迅速，不呈時間依賴性，酒精和乳混合后立即測定膠體粒子的半徑，在后續時間內關系函數的累計保持恒定，即在任何特定的酒精濃度情況下，膠體半徑不隨時間變化，這種恒定性僅表現在乙醇臨界變性濃度以下時，超過臨界的乙醇濃度，膠體半徑依賴于pH值、Ca^2＋濃度和時間而增加。

（2）酒精對酪蛋白膠體作用引起的變化

上面討論了酒精作用于乳蛋白后酪蛋白膠體粒子直徑的變化，但未確定凝集的速度。膠體粒子半徑崩塌后是否在高濃度酒精作用下進一步的變化如表2-5所示。隨著膠體濃度的下降，將不發生凝集階段的變化，在較高酒精濃度的情況下，膠體粒子的體積不繼續下降。從表中還可看出，酒精使膠體粒子半徑變小有臨界值，超過其濃度以后已變化的膠體呈穩定性，即隨著毛發狀結構的崩塌，膠體粒子下降至一定的最小值，它被定義為“核”半徑。

表2-5　添加酒精后酪蛋白膠體濃度對其流體力學半徑的影響　單位：nm

酪蛋白膠體粒子的半徑介于30～600nm，分散的范圍和區間較大，故通常僅有平均流體力學半徑的測定結果。為了避免膠體粒子分布變化引起的影響，Horne和Dalgleish（1985）試圖通過引入測定障礙層流體力學厚度（barrier layer hygrodynamic thickness）的方法來表示酒精對酪蛋白作用的變化。障礙層厚度隨膠體體積的增加而增加，這種結果和κ-酪蛋白外層的簡單圖像是不一致的；在這種模型中，可以推測無論粒子體積大小均有相同的障礙層厚度。大量研究表明，障礙層厚度測定法不能完全適用于酪蛋白膠體粒子。

鈣離子濃度的增加，降低了酒精使酪蛋白膠體粒子崩塌的臨界濃度，這歸因于專一性的鈣離子結合減少了蛋白質的負電荷，降低了內部“毛發狀物”的排斥和使它們更易崩塌，這種影響類似于單獨酪蛋白的鈣誘導凝聚。隨著pH值的升高，障礙層的強度增加，從而防止酪蛋白變化的耐受性增加，這和酪蛋白磷酸鹽較大程度的離子化（pK≈6.5）引起的電荷增加的結果相一致。隨著離子強度的增加，Ca^2＋和酪蛋白的結合能力下降，這種下降意味著蛋白質電荷的上升，引起κ-酪蛋白間的排斥作用和障礙層強度增加，在高離子強度下酒精穩定性的可逆，可理解為平衡時酪蛋白膠體的收縮過程最終變為主要伴隨因素。

障礙層厚度不是保持不變的，從膠體核半徑作為不同離子變化函數可以看出，障礙層厚度下降不僅來源于無酒精溶液中膠體流體力學半徑的下降，也來自實際核半徑的增加，實際核半徑的增加是障礙層減少的主要原因，此時酪蛋白膠體會明顯變硬，空間穩定性層從內部變薄，許多研究者認為空間穩定層具有弱凝膠的許多性質，在酪蛋白膠體中沒有實際的吸附層被當做凝膠處理，但這和認為酪蛋白膠體是由構成蛋白分子廣泛交聯而成的微膠體粒子的想法是等同的，這種模型能很好地說明酒精作用于酪蛋白后其體積和半徑的變化。由于這種模型表明酪蛋白外層“毛發狀物”不僅連接于膠體表面且彼此連接，同時隨著電荷下降，這種模型認為交聯增加和表面層較多的核部分，即是說核半徑的增加通過外層區域的進一步鍵合來完成，這種結合和早已在膠體內部形成的結合物理和化學性質沒有不同。類似地隨pH值上升，電荷增加，排斥作用隨之增加，使交聯作用變弱，毛發狀蛋白不能伸展引起流體力學半徑增加。

上述模型可通過高度交聯情況下穩定性的護層較少受酒精作用來進一步驗證。當穩定性層較薄體系不穩定，較多交聯作用的存在情況下呈空間穩定，和交聯較少的體系比較而言，其毛發狀結構不易崩塌和不易受酒精影響。Horne和Davidson（1986）研究表明流體力學半徑對酒精濃度的梯度變化，可表示空間穩定性外層對酒精誘導崩塌的敏感性，曲線的斜率隨pH值上升線性增加。用微凝膠模式的定性說明，隨pH值上升交聯作用下降凝膠護層減弱而使空間穩定障礙層變“軟”。值得說明的是變軟不一定伴隨穩定性下降，因為障礙層變軟的同時也變厚，總厚度是膠體穩定性的決定因素。

（3）乳蛋白酒精不穩定性的機制

乳礦物元素的溶解性在添加酒精時被減少，Pierre認為Ca₃（PO₄）₂的沉淀是酪蛋白不穩定性的根源，這種沉淀中和了酪蛋白電荷，導致空間穩定性（排斥力）下降而使乳體系不穩定。從另一個角度來看，Ca₃（PO₄）₂的沉淀對乳有穩定作用，Horne和Davidson（1986）證實，降低Ca^2＋在溶液中的水平增加了穩定性毛發層的厚度，使酪蛋白趨于穩定，酒精誘導的Ca^2＋沉淀也導致相同的變化，即降低了游離鈣的水平（使酪蛋白結合鈣呈另一種形式），從而增加穩定層的厚度和增加了膠體電荷。酒精濃度越高，Ca₃（PO₄）₂沉淀越快越多。和這種有利作用相對，酒精對酪蛋白膠束的不穩定影響是加速其交聯和空間穩定層的崩塌。主要排斥力的降低以數量級的大小加速膠束凝聚。Ca₃（PO₄）₂沉淀引起的電荷、構象變化速度較快，但仍需一定的時間。故若凝集反應發生的速度快于來自Ca₃（PO₄）₂沉淀的電荷、構象調整反應速度，則凝集反應發生，膠束粒子的沉淀形成。

乳酒精穩定性和pH值間的S形圖也可由pH值對磷酸鈣溶解性的影響來說明，乳酸化時膠體磷酸鈣溶解，磷酸鈣主要由小晶體構成，這種小晶體有較大的表面積，易溶解，且在酒精作用下能形成磷酸鈣的再沉淀。提高pH值，促進了Ca₃（PO₄）₂的沉淀反應，改善了穩定性，需用較高量的酒精來克服已增加了的障礙層（能壘，energy barrier），即用較高濃度的酒精才能使乳膠體沉淀。

酒精穩定性隨離子強度的上升而下降，這可通過高離子強度下Ca₃（PO₄）₂沉淀生成的抑制來說明，由于這種沉淀抑制作用，引起來自酪蛋白的鈣離子需要量減少，從而導致沉淀酪蛋白酒精濃度的下降，這種理論是以離子強度無酒精存在下對礦物元素溶解性和磷酸鹽pK值的影響為基礎的。Pieere（1985）認為鹽的溶解性也依賴于混合物的介電常數，礦物元素的沉淀作用能很好地說明酒精穩定性和沉淀混合物介電常數間的關系。

磷酸鈣沉淀的穩定作用為乳清相組成能控制酪蛋白穩定性的想法提供了依據。當乳預熱時，加熱引起的Ca₃（PO₄）₂沉淀能提高酒精誘導礦物元素沉淀的有效性，故曲線向鈣利用性下降的方向轉移，導致穩定性的增加。

早期的酒精試驗都是用未調整pH值的天然牛奶進行的。Horne和Paker（1980）改用調整pH值后的牛奶進行試驗，發現了牛奶pH值與酒精試驗穩定性間存在特定的關系。典型的關系曲線呈S形，見圖2-8。穩定性隨pH值的上升而增大。如果不斷提高牛奶的pH值，膠粒穩定性隨之增大。如果pH值足夠大，牛奶中添加等體積的無水乙醇也不會引起沉淀。Horne等因此提出酒精試驗應改為向1體積的牛奶中加入2體積的酒精溶液，用特定pH值下立即引起牛奶蛋白質沉淀的酒精濃度來表示牛奶酒精穩定性的大小。典型的牛奶酒精穩定性-pH關系曲線可以用以下四個參數來描述：S形曲線在低pH值，高pH值兩臂的漸近值S_min、S_max，曲線拐點處的pH-pK值及斜率參數b。

1928年Leightion等人在其提出的牛奶酒精凝固機制中認為，乙醇使乳清蛋白變性，變性的乳清蛋白沉降到酪蛋白膠粒上引起酪蛋白的沉淀。但交叉透析實驗結果表明乳清蛋白并不參與牛奶的酒精沉淀過程，牛奶pH值與酒精穩定性關系是由乳清中可擴散組分決定的，與乳清蛋白無關。乳糖和尿素的添加對曲線的影響很小。而牛奶中Ca^2＋的加入則使曲線向右向下移動（移向高pH值方向），但S_max、S_min值的變化并不大。以EDTA處理除去Ca^2＋產生相反的作用，整個曲線移向低pH值方向。添加磷酸鹽或檸檬酸鹽螯合Ca^2＋，產生相同的效果，作用能力與Ca^2＋螯合能力相一致。這一發現與1958年Danies和White提出的天然pH值的牛奶其酒精穩定性與奶中Ca^2＋濃度呈顯著的相關性（見圖2-9），一般看法是：當提高牛奶pH值時，由于二次電離的磷酸根離子的影響，游離Ca^2＋濃度下降，牛奶乙醇穩定性升高；pH值降低時有更多的Ca^2＋被釋放，乙醇穩定性下降。圖2-8的關系曲線之所以會在這一pH值范圍內出現一個拐點是與磷酸根的電離特性分不開的。牛奶的乙醇穩定性是由游離Ca^2＋濃度所決定的，鹽平衡比率則是通過對Ca^2＋濃度的影響而起作用的。

預熱、濃縮等加工處理對牛奶的酒精穩定性也會產生影響。奶預熱時，由于磷酸鈣的形成可溶性鈣減少，酒精穩定性增大。Horne和Parker的研究發現原料奶的組成與濃縮奶的酒精穩定性存在確定的關系，如果奶pH值較高，即在S形曲線的堿性側，濃縮對牛奶的酒精穩定性影響則很小。這與在正常濃度牛奶中添加NaCl后出現的情況很相似。將pH值固定時，牛奶酒精穩定性與奶中Cl^－濃度作圖，可以發現，pH值在6.8以上時牛奶的酒精穩定性線性下降。用濃縮或直接添加Cl^－的方法提高Cl^－濃度，所引起的結果都相似。這表明對pH值高于天然牛奶的牛奶濃縮物，其酒精穩定性是由系統中的離子強度所決定的。通過濃縮前進行透析處理除去部分Cl^－方法，可提高濃縮物的酒精穩定性。

通過比較脫脂牛奶的乙醇穩定性和在乙醇緩沖液中的酪蛋白膠束的聚集穩定性的數據可以發現，當調整Ca^2＋和pH值時，絕對穩定性和相對反應發生了變化，并且脫脂牛奶和乙醇緩沖液中的酪蛋白膠束的實驗結果正好相反。增加離子強度調整pH值到7.0則降低了酒精穩定性；若增加緩沖液的離子強度卻增加了酪蛋白膠束的酒精穩定性。因此可以提出如下假設：酒精穩定性的不同是由于將乙醇加入脫脂牛奶中同時發生的磷酸鈣的沉淀引起的。從酪蛋白鹽膠束中分離出鈣，正好抵消了乙醇導致的膠束不穩定。這去除鈣和結構的重組是動態控制的，當膠束凝結時間達到結構重組時間時，最終發生脫脂牛奶中膠束沉淀。

（三）熱穩定性與酒精穩定性的相關性

測試牛奶的熱穩定性主要有兩種方法：①測定在一預先選定的溫度下凝塊形成的時間；②測定pH值調整后的牛奶迅速（2min內）出現凝固所需的溫度。本節主要討論后一方法的實驗結果，這一方法最早是由Miller和Sommer提出的。典型的牛奶pH值與熱凝固溫度關系曲線見圖2-10。該曲線與酒精穩定性曲線很相似，也呈S形，低pH值時穩定性最低，高pH值時穩定性最大。酒精穩定性函數表達式對熱穩定性數據也適用，但熱穩定性曲線pK值較小，曲線較靠近pH軸原點。

圖2-10也給出了鈣、磷的添加對牛奶熱穩定性的影響。鈣離子的添加或除去對熱穩定性的影響與對酒精穩定性的影響相似。Ca^2＋濃度提高時，牛奶穩定性下降，曲線移向pH軸右方；用Ca^2＋螯合劑降低牛奶中有效Ca^2＋濃度時，穩定性增加，曲線移向低pH值方向。磷酸鹽對牛奶熱穩定性能產生顯著的影響，檸檬酸鹽（5mmol/L）也同樣有效。但添加磷酸鹽對pK值的大小幾乎不產生影響。

試驗表明牛奶的酒精穩定性和熱穩定性之間有很好的相關性。兩者對pH值調整具有相同的反應，對Ca^2＋濃度變化的反應至少在定性方面是一致的，這種相似表明影響兩種試驗結果的可能是同一反應途徑。我們知道酪蛋白膠粒之所以能穩定存在是由于顆粒間存在足夠大的排斥能，能防止沉淀的出現，根據Arrhenius公式：

lnK=lnA-E/（RT）

式中　K——反應速率常數；

A——碰撞頻率因子；

R——摩爾氣體常數；

T——熱力學溫度；

E——活化能。

光散射研究表明，次臨界濃度的乙醇使膠粒外具有空間位阻作用的毛發樣結構皺縮，失去空間位阻作用，但這時的牛奶體系中仍存在一種排斥性靜電組分，聚集前必須將其克服。為了方便可做簡化處理，把活化能E寫作：

E=N₀εψ²

式中　N₀——阿伏加德羅常數；

ε——介電常數；

ψ——靜電表面勢。

因此lnK=lnA-N₀εψ²/（RT）。

這樣，當酒精濃度提高時，介電常數ε減小，lnK增大直至出現迅速凝集。當然溫度的提高也可增大lnK值使蛋白發生熱凝固。這首先需要假定牛奶發生迅速凝固的各種情況下表面勢ψ值大小都接近，這一點還有待證明。

本節主要沿用Miller和Sommer的定義討論了pH-牛奶熱凝固溫度與酒精穩定性曲線間的相關性。而現今研究牛奶熱穩定性時更常用的是測定標準條件下（對正常濃度牛奶為140℃，對濃縮奶為120℃）發生凝固所需的時間，這已成為牛奶熱穩定性研究的標準方法，近年有關熱穩定性研究的報道及機制探討主要建立在這一標準方法的基礎上。

（四）光散射試驗

1.牛乳散射理論

光散射是由相對較大（大于分子大小）的粒子造成的，粒子的折射率往往不同于其周圍介質。牛乳中脂肪球和酪蛋白膠束對光散射影響較大。由于乳清蛋白和體細胞的分子相對較小、濃度低，所產生的光散射則可以忽略。

粒子將入射光向各個方向散射，如圖2-11所示，圖中I₀為初始發光強度。

我們可以從不同的角度（如入射光呈90°）測定散射強度，這種測定方法通常適用于粒子大小比波長小得多的懸浮體；散射強度大致與粒子的體積平方、折射率的平方呈正比關系，而與波長的4次方呈反比關系。另一種測量方法是測定濁度（系由散射造成的入射光的衰減），通常以吸光度或光密度表示。濁度同樣受諸多因素影響，且因為這一技術用于大顆粒，其相互之間的關系就更為復雜。

脂肪球是相對比較大的球狀顆粒，若其濃度足夠低的話，則可較容易地計算出濁度大小。對于可見光來說，吸光度A可近似地通過下式計算：

A=0.5τV （L/λ）

式中　V——脂肪球體積；

L——光路長度；

τ——比濁度；

λ——波長。

乳脂肪比濁度與d/λ之間的關系可由圖2-12給出（其中d為脂肪球直徑），圖中所示僅是一種較為理想的簡化模型，因為比濁度還受到儀器設置等因素的影響。脂肪球和等離子體的折射率差異會影響濁度的大小，并隨著波長的變化而變化。乳脂肪的折射率波動很大，其變化范圍為1.452～1.457。脂肪球的大小不一是造成濁度曲線變寬變平坦的原因；脂肪球的不均勻程度越高，多分散性質也越明顯。根據圖2-12（此時d代表的是脂肪球的平均直徑）并結合公式，可以估算出A值大小和脂肪含量。乳脂肪的多分散性和折射率的測定誤差較大，而測定其濁度（特別針對某一波長范圍）是估算脂肪球平均直徑和分散度的方便有效的方法。

酪蛋白膠束比脂肪球要小得多（d/λ=0.02～0.50），因此其散射光也少。膠束的不均勻性是造成散射結果復雜的原因。當膠體磷酸鈣的含量增加時，其散射強度也大大增強。

牛乳是一個濃縮分散體，對于一事先未經稀釋的牛乳來說，其散射理論將更加復雜。當離子間距接近或小于一個波長大小時，散射將被削弱。另一種復雜的情況就是多次散射，即光線經一次散射后到達另一粒子進行多次散射（如圖2-11所示），在一未稀釋的牛乳中散射次數可達到1000次甚至更多。

2.牛乳的吸收與漫反射理論

牛乳吸收可見光的能力較弱。乳清中含有的核黃素是造成乳清呈黃綠色的主要原因。乳清的最大吸收波長約為0.47μm，其比消光系數為0.05cm^-1（即光路長度為1cm情況下吸收為0.05），其中有部分吸收能量以熒光（λ=0.53μm）形式釋放。乳脂肪中含胡蘿卜素使牛乳呈現黃色，其最大吸收接近0.46μm，比消光系數的變化范圍較大。

在紫外區，蛋白質的芳香環（酪氨酸和色氨酸殘基）在λ=0.29μm處有強吸收，脂肪的雙鍵在0.22μm處有強吸收。在紅外區，許多強吸水性鍵在λ＞1.2μm（1.7μm附近除外）時有強吸收，它使牛乳變得不透明。其他的一些化學鍵也有其相應的強吸收，如CH2的吸收波長為3.45μm，脂肪族為5.70μm，肽鍵為6.50μm（主要是蛋白質），未解離的—COOH為5.90μm，OH則在3.50μm和9.60μm附近均有吸收。根據以上吸收的強弱，可以預測牛乳主要成分的含量。

均質牛乳的漫反射譜線由圖2-13給出，該譜線是通過測定經表面反射后的各個方向（鏡面反射除外）的光線的數據而得到的。測定的結果，特別是整條曲線各水平的分布與實驗安排密切相關。液態物質（如牛乳）的漫反射由一定厚度（通常為幾毫米）的液面層中粒子產生的多次散射造成。光線在牛乳中通過的路徑同樣值得考慮，因為某些波長范圍的光會在中途被吸收；圖2-13曲線中在波長0.46μm附近出現的低谷就是光線被吸收的緣故。牛乳中β-胡蘿卜素在0.46μm附近恰有強吸收，它是牛乳呈“奶油色”的主要原因。全脂乳與脫脂乳產生的漫反射的比較見表2-6。脫脂乳由于粒子較少，反射光也相對較少一些；但在短波長區域，由于沒有β-胡蘿卜素的吸收其反射率則高于全脂乳。酪蛋白反射短波藍色光的效果比反射紅色光要好，這是脫脂乳呈藍色的主要原因。脫脂乳中核黃素在波長為0.45μm處有少量吸收。表2-6還表明均質能增強漫反射，這使牛乳增白；色差雖然很小，但肉眼可以觀察到。

熱處理能使牛乳的顏色發生改變。從圖2-13看出，加熱剛開始的時候，牛乳稍微有點變白；通常將這一現象歸因于乳清蛋白變性造成散射粒子的增多，但似乎更主要的原因是酪蛋白膠束的膠體磷酸鹽含量上升所致。隨著加熱程度的增強，將發生美拉德反應，反應產生的褐色素將明顯改變反射圖譜，特別是在短波長區域。在實踐中，我們通常采用與標準色澤比較的方法，通過感官（色覺）來評估加熱產生的褐變程度。

光線穿過乳制品的狀況對于某些光觸反應來說非常重要。任何光線通過一渾濁溶液時都將被反射（包括漫反射）或被吸收。散射吸收得越多，光線深入的深度越淺，如表2-6所示。在這里穿透定義為光線深入液體的厚度，同樣這一特性也與具體的實驗條件密切相關。