3.3　實驗技術

3.3.1　樣品的制備

樣品制備要求基本與紫外-可見吸收光譜樣品制備要求相同。但樣品中熒光物質、溶劑和溶質分子之間往往存在相互作用，使熒光強度降低或與濃度不呈線性關系。上述現象稱為熒光猝滅。發生熒光猝滅的原因有以下幾點。

①熒光物質與能引起熒光猝滅的其他物質（即熒光猝滅劑）碰撞造成能量損失；

②熒光物質與猝滅劑作用生成了不發光的配合物；

③熒光物質中加入溴化碘后易發生無輻射去活化過程；

④熒光物質發生自吸收或聚合；

⑤溶解氧引發的氧化或促進無輻射去活化過程。

溶劑對樣品中熒光物質的熒光強度影響表現為：溶劑極性增大使熒光波長向高波長方向移動，強度增強；溶劑黏度減小，分子間碰撞機會增加，無輻射躍遷機會增加，導致熒光減弱；溶劑與熒光物質形成化合物或溶劑改變熒光物質的電離狀態。每種熒光物質都有適合的pH范圍。

3.3.2　熒光分析新技術

在實驗中，除了前面講到的熒光光譜技術，還包括時間分辨發光光譜技術、同步掃描技術、三維熒光、固體表面熒光測定等新技術。

（1）時間分辨發光光譜技術

時間分辨發光光譜技術是基于不同發光體的發光衰減速率的不同，配置帶時間延遲設備的脈沖光源和帶有門控時間電路的檢測器件，通過選擇延遲時間t_d和門控時間t_g，對發射單色器進行掃描，得到時間分辨發射光譜，從而實現對光譜重疊但發光壽命不同的組分的分辨和分別測定。也可以固定激發波長與發射波長，對門控時間進行掃描，得到發光強度隨時間的衰減曲線，從而實現發光壽命的測量。

（2）同步掃描技術

根據激發和發射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系，同步掃描技術可分為固定波長差、固定能量差和可變角（可變波長）同步掃描。同步掃描技術具有光譜簡化、譜線窄化、分辨率提高、光譜重疊減少、選擇性提高、散射光影響減少等諸多優點。

同步熒光光譜分析法是提高分析選擇性、解決多組分熒光物質同時測定的良好手段之一。

（3）三維熒光

普通熒光分析所測得的光譜是二維譜圖，包括固定激發波長、掃描發射波長所獲得的發射光譜，及固定發射波長、掃描激發波長所獲得的激發光譜。但是，實際上熒光強度應是激發波長和發射波長這兩個波長變量的函數。描述熒光強度隨激發波長、發射波長變化的關系圖譜，即為三維熒光光譜。

由于三維熒光光譜反映了發光強度隨激發波長和發射波長變化的情況，因而能提供比常規熒光光譜和同步熒光光譜更完整的光譜信息，可作為一種很有價值的光譜指紋技術。

（4）固體表面熒光測定

固體表面熒光測定有兩種方法：一種是直接測定固體物質表面的熒光；另一種是將待測組分吸附在固體物質表面，然后進行熒光測定。采用的固體物質品種眾多，有硅膠、氧化鋁、濾紙、硅酮橡膠、乙酸鈉、溴化鉀、纖維素等。

固體表面熒光測定常與薄層色譜法或高效薄層色譜法聯合使用。樣品點滴在薄層色譜板上，經分離后對各個組分進行熒光強度的測定以及熒光發射光譜和熒光激發光譜的測繪。用樣品的熒光強度和標準物質的熒光強度對比可以進行定量分析。