1.5　Nano-HA粉體微核試驗

微核技術是一種簡單、快速、在細胞學水平上篩查染色體損傷的方法，評價材料、藥物、放射線及細胞毒性物質對人、動物及體外細胞損傷程度時，按照YY/T 0127進行。微核來源于染色體斷裂形成的片斷或因紡錘體紊亂形成的整個滯后的染色體。由于某種理化因子的作用，有絲分裂間期的細胞受到傷害，在有絲分裂間期，這種斷片落后于向兩極移動的染色體，而滯留于細胞質中，當其他染色體復制形成子細胞核時，這些落后的斷片在子細胞中演變為微核，形成主核旁邊的一個或多個“小核”。微核染色體的結構和顏色深淺同主核相似，轉動微調時，與主核處于同一平面，呈圓形或橢圓形，界限清楚，包含于胞漿中，直徑為主核的1/20～1/5，并與主核不相連；微核完整，不重疊，但死亡或降解的細胞除外^［25］。各種文獻報道中，正常對照的微核數也有很大的差異，但藥典中的陽性標準是5‰^［26］。

1.5.1　微核試驗方法

選用實驗組同溶血試驗相同。實驗動物為健康昆明小鼠30只，體重為20～25g，將小鼠隨機分成6組。陰性對照組與實驗組小鼠分別按體重靜脈注射劑量為0.1mL/20g生理鹽水、材料浸提液、混懸液，陽性對照組按體重注射80mg/kg環磷酰胺，兩次腹腔注射染毒，間隔24h。第二次染毒6h后，頸椎離斷法處死小鼠，迅速剪下小鼠兩條股骨，除去筋膜肌肉，剪去股骨兩端，用注射器吸取1mL小牛血清推入骨髓腔中，將骨髓沖洗入離心管中，反復沖洗至骨髓腔中無血。然后以1000r/min的轉速離心5min，棄去上清液，用毛細管吹打沉淀物，吸少許均勻涂片。每只小鼠涂片兩張，晾干后用甲醛固定，用0.25%M-G染液染色，再以1∶10Giemsa液染色10min，用蒸餾水分色10s，晾干后進行鏡檢，高倍鏡下選擇細胞分布均勻、染色好的區域，鏡下計數骨髓嗜多染紅細胞（PCE）數，PCE在油鏡下呈灰藍色。微核直徑相當于PCE的1/20～1/5，呈圓形，邊緣光滑，與其他有核細胞核質一樣染成紫紅色或藍紫色。一個PCE中出現兩個以上的微核按一個微核細胞計，計數每2000個PCE細胞中含微核的PCE數，結果以‰表示。

1.5.2　微核試驗結果

微核試驗中取每只試驗鼠計數2000個PCE細胞，并觀察含微核的PCE數，其結果見表1-8。陰性對照組、實驗組微核率范圍在1.0‰～1.8‰，陽性對照為23.5‰。所有試驗組均低于藥典的陽性標準5‰，無致突變反應。說明不同分散的Nano-HA均沒有造成細胞過度損傷。

表1-8　各組樣品微核試驗結果比較