1.6　HA局部植入試驗(yàn)

1.6.1　局部植入試驗(yàn)方法

以Nano-HAⅠ（乙醇分散）和Nano-HAⅡ（鈰鹽分散）為實(shí)驗(yàn)組，未進(jìn)行分散處理的HA為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為32只新西蘭兔，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心提供，雌雄不限，體重為2.5～3.5kg，普通環(huán)境飼養(yǎng)，術(shù)后1周、4周、8周和12周取材，每種試驗(yàn)樣每個(gè)試驗(yàn)期為4只。

手術(shù)過程采用速眠新注射液0.3mL/kg肌肉注射，麻醉顯效后，動(dòng)物側(cè)臥于兔臺(tái)綁定后，于股骨外側(cè)皮膚剪毛，在0.5%碘伏消毒術(shù)區(qū)，鋪無菌手術(shù)單，于股骨外側(cè)髁處縱行切開并逐層分離皮膚、皮下組織、肌肉、骨膜，顯露股骨外側(cè)髁，用慢速牙鉆機(jī)與生理鹽水冷卻下在外側(cè)髁下方骨皮質(zhì)處鉆3個(gè)直徑為2mm的孔，間隔8mm。用生理鹽水反復(fù)沖洗創(chuàng)區(qū)，充分止血，將預(yù)先用生理鹽水調(diào)和后的干燥成型的不同粉體塊材植入創(chuàng)區(qū)，在骨植入?yún)^(qū)外側(cè)分離臀大肌成肌袋3處，植入同種2mm直徑的材料，分層對(duì)位縫合創(chuàng)口，碘伏消毒創(chuàng)區(qū)，術(shù)后連續(xù)5天每日一次肌注慶大霉素0.5mg/kg、預(yù)防感染，并觀察動(dòng)物狀態(tài)、創(chuàng)口愈合情況。

術(shù)后1周、4周、8周和12周，每組試驗(yàn)樣各處死4只動(dòng)物，立即將含修復(fù)區(qū)周圍組織（股骨及肌肉組織的復(fù)合組織塊體）離體取出，采用生理鹽水沖洗后，置于10%甲醛中固定24h；完成骨組織脫鈣（脫鈣液為硝酸∶甲酸∶蒸餾水=2∶2∶6）后，制作常規(guī)組織切片、HE染色，并置于Olympus BH-2型顯微鏡下觀察。

1.6.2　局部植入試驗(yàn)結(jié)果及分析

植入試驗(yàn)是用體內(nèi)植入的方法評(píng)價(jià)宿主組織對(duì)材料的生物學(xué)反應(yīng)。評(píng)價(jià)的生物學(xué)指標(biāo)包括：纖維化程度；炎癥程度；組織變性；界面炎細(xì)胞類型；是否存在壞死；材料碎片脂肪浸潤；肉芽腫等。對(duì)骨組織主要觀測(cè)骨組織與材料的界面處，應(yīng)評(píng)價(jià)植入體與骨的接觸面積和植入物周圍骨的數(shù)量及其間的非鈣化組織，以及骨吸收和骨形成的情況。

（1）肌肉植入實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般狀況良好，創(chuàng)口無感染，也無植入物排斥反應(yīng)。肉眼觀察，植入部位肌組織無異常，材料與肌肉結(jié)合緊密，材料周圍無骨組織產(chǎn)生，HE組織學(xué)觀察見圖1-7。1周時(shí)，界面周圍的肌肉內(nèi)可見到少量到中等程度的炎癥細(xì)胞浸潤，材料周圍可見到不同程度的成纖維細(xì)胞和纖維組織增生；4周時(shí)，浸潤的炎癥細(xì)胞開始減少，纖維組織、細(xì)胞成分逐漸穩(wěn)定；8周時(shí)，纖維包膜變薄，纖維組織長入材料內(nèi)部；12周時(shí)，浸潤的炎癥細(xì)胞消失或已經(jīng)很少見，周圍肌組織始終保持正常結(jié)構(gòu)。各期Nano-HAⅠ組、Nano-HAⅡ組和普通HA組的組織反應(yīng)略有差異，相對(duì)比較8周和12周時(shí)，Nano-HAⅠ組、Nano-HAⅡ組發(fā)現(xiàn)少量膠原纖維和纖維細(xì)胞長入材料間隙中，肌肉組織和材料有的難以分清。

肌內(nèi)植入試驗(yàn)可見，材料周圍無新骨形成，表明Nano-HA無骨誘導(dǎo)活性，同時(shí)材料僅引起一過性的炎癥反應(yīng)，并且未見異物反應(yīng)，從而證實(shí)Nano-HA具有高度的組織相容性，植入機(jī)體后能很好地被機(jī)體“容受”。

（2）骨內(nèi)植入試驗(yàn)

材料與骨組織HA染色圖像見圖1-8。1周的脫鈣骨組織切片鏡下可見材料與骨組織之間無肉芽組織，材料周邊有纖維骨痂形成；各組材料亦見大量的纖維骨痂長入材料，材料周圍形成纖維組織，周圍骨組織對(duì)三種材料的反應(yīng)無明顯差異。4周時(shí)，Nano-HAⅠ組和Nano-HAⅡ組，材料周圍可見大量骨基質(zhì)出現(xiàn)，纖維骨痂已經(jīng)開始鈣化成骨，但未出現(xiàn)明顯的鈣化線，生長良好的新生骨組織長入材料內(nèi)部，材料周圍可見成骨細(xì)胞；對(duì)照HA也可見骨基質(zhì)形成，新生骨長入材料內(nèi)部。8周時(shí)，Nano-HAⅠ和Nano-HAⅡ材料周圍已有大量的新生骨組織，并可見染色較淺的骨基質(zhì)新沉積于材料周邊，骨纖維形成鈣化線，新生骨膠原纖維組織呈同心圓排列，即將形成哈佛氏系統(tǒng)；對(duì)照HA組亦見有新生骨形成，但并未見哈佛氏系統(tǒng)的形成。12周時(shí)，可見Nano-HAⅠ和Nano-HAⅡ已可見較成熟的骨組織，但骨纖維排列尚欠規(guī)則，骨創(chuàng)完全愈合，新生骨與周圍骨相接成為一體，充填的材料基本消失，材料周圍的骨已趨于成熟，有成熟的骨陷窩，已形成較成熟的哈佛氏系統(tǒng)；對(duì)照HA可見大量新生骨生長，有一定量殘留的材料，哈佛氏系統(tǒng)少見，新生骨的成熟程度較差。

骨對(duì)種植其內(nèi)的材料的響應(yīng)，將有兩種修復(fù)過程發(fā)生，并相互競爭。一種是普通機(jī)制，骨組織在材料周圍將形成纖維包裹；另一種可能是如移植骨一樣，材料在界面及鄰近區(qū)域允許或刺激新骨形成。骨內(nèi)植入試驗(yàn)顯示出Nano-HA有良好的骨組織相容性；可以提高骨創(chuàng)的愈合能力，材料周圍有明顯的新骨形成，材料與新骨之間無纖維膜形成，最終材料被降解掉，材料所在區(qū)域被新生骨組織取代，材料與骨髓組織相容性好，并且不影響骨髓組織的新生。