1.4　Nano-HA粉體溶血試驗

溶血試驗是用于評價長期與骨組織或軟組織接觸的材料的體外急性溶血活性。通過材料與血細(xì)胞在體外接觸過程中所致紅細(xì)胞溶解和血紅蛋白游離程度的測定，對材料的體外溶血性進行評價。該試驗?zāi)苊舾械胤从巢牧蠈t細(xì)胞的影響，故是一種特別有意義的材料篩選試驗。采用YY/T 1532—2017《醫(yī)療器械生物學(xué)評價納米材料溶血試驗》，通過對不同兔血的反應(yīng)測定，其平均溶血率為5%。一般來講，具有毒性物質(zhì)的材料所造成的溶血反應(yīng)程度較其在細(xì)胞培養(yǎng)中所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)程度大，當(dāng)在溶血試驗中測得有溶血活動時，可提示材料有毒性。

1.4.1　溶血試驗方法

進行溶血試驗時采用Nano-HAⅠ生理鹽水浸提液、Nano-HAⅠ生理鹽水混懸液（10mg/mL）、Nano-HAⅡ生理鹽水浸提液、Nano-HAⅡ生理鹽水混懸液（10mg/mL）4組材料。

穿刺新西蘭兔心臟取血20mL，加入1mL 20g/L草酸鉀制成新鮮抗凝血，取8mL抗凝血加10mL生理鹽水稀釋。將試驗材料樣品分為4組，每組3份，分別加入浸提液10mL，置于37℃水浴中保溫30min。陽性對照組為10mL蒸餾水3份，陰性對照組為10mL生理鹽水3份。18只試管中均加入0.2mL稀釋兔血，混勻后，置于37℃水浴箱中保溫60min，1000r/s離心5min，吸取上清液移入比色皿中，用721分光光度計在波長為540nm處測吸光度，根據(jù)結(jié)果按公式計算溶血度。

1.4.2　溶血試驗結(jié)果

相關(guān)的ISO標(biāo)準(zhǔn)要求試驗組中陽性對照組吸光度值應(yīng)在0.8±0.5范圍內(nèi)，陰性對照組吸光度值應(yīng)小于0.03，否則不可進行。標(biāo)準(zhǔn)溶血濃度小于5%為不溶血。本試驗各試驗組溶血率均小于5%，見表1-7。

表1-7　各組Nano-HA溶血程度

按照標(biāo)準(zhǔn)建議的方法，對Nano-HA的溶血活性進行測試，同時考慮到Nano-HA的粒子尺寸大小的特點，有通過毛細(xì)血管壁（內(nèi)徑為8～10μm）進入血液循環(huán)的可能，測試了10mg/mL混懸液的溶血率，結(jié)果均小于5%，故認(rèn)為不同分散處理Nano-HA材料無溶血反應(yīng)。