1.3　HA粉體急性毒性檢測實驗

生物材料的急性毒性試驗按GB/T 16886.11—2011進行。一般指機體（實驗動物）一次或24h內多次接觸外來化合物之后所引起的中毒效應，甚至引起死亡。其途徑可包括經口、經皮、經腹腔、經靜脈等不同的給予方法，可以從不同角度了解不同處理的HA粉體進入機體后的全身代謝和造成的機體毒性反應，從而評價生物材料的急性毒性作用。

1.3.1　實驗材料及方法

選用不同HA粉浸提液和混懸液（濃度為10mg/mL）、普通HA粉末浸提液。實驗動物為18～22g健康昆明小鼠（黑動字第99101001號）77只，由佳木斯大學動物中心提供。

將77只小鼠，隨機分成11組，分別進行腹腔注射生理鹽水（對照組）、HA微粉浸提液、乙醇分散Nano-HAⅠ浸提液和Nano-HAⅠ混懸液、鈰鹽分散Nano-HAⅡ浸提液和Nano-HAⅡ混懸液。尾靜脈注射生理鹽水（對照組）、乙醇分散Nano-HAⅠ浸提液和Nano-HAⅠ混懸液、鈰鹽分散Nano-HAⅡ浸提液和Nano-HAⅡ混懸液，注射劑量為50mL/kg。注射后，0h、24h、48h、72h、168h稱量小鼠的體重，觀察記錄動物的一般狀態，毒性表現和死亡動物數。材料毒性程度根據中毒癥狀分為無毒、輕度毒性、中度毒性、重度毒性和死亡。一周處死小鼠，解剖觀察臟器變化，肝臟、腎臟做組織切片，鏡下觀察，對于混懸液組，觀察有無Nano-HA栓塞在臟器的血管內。注射后動物反應觀察指標見表1-2。

1.3.2　實驗結果及分析

所有動物在注射后1周內的活動、進食正常，無驚厥、癱瘓、呼吸抑制、死亡等不良反應，無肉眼可見的毒性表現，1周后動物解剖臟器觀察，無壞死、出血、變性等病理表現，且未發現納米羥基磷灰石造成血管栓塞的現象。各組小鼠在24h、48h、72h和168h（1周）的體重變化見表1-3和表1-4。各試驗組腹腔注射與尾靜脈注射各時期小鼠體重變化與陰性對照組比較的統計分析見表1-5和表1-6。

結果顯示所有腹腔注射的小鼠各實驗組和空白對照組比較24h、48h、72h和168h的體重變化沒有顯著差異。尾靜脈注射小鼠中Nano-HAⅠ浸提液組和Nano-HAⅡ浸提液組與空白對照組比較24h、48h、72h和168h的體重變化，沒有顯著差異；Nano-HAⅠ混懸液組、Nano-HAⅡ混懸液組與空白對照組比較24h、48h、72h的體重變化，有顯著差異，168h顯著差異。

圖1-6是鈰鹽分散的Nano-HAⅡ混懸液注射腹腔后小鼠肝臟和腎臟HE組織學圖像。10倍觀察小鼠肝臟和腎臟組織學，觀察未見變性、壞死等異常［圖1-6（a）和圖1-6（c）］；40倍觀察肝細胞多邊形，細胞界線清晰，核膜清楚，核仁可見［圖1-6（b）］；40倍觀察腎小球、腎小管、血管均未見異常［圖1-6（d）］。組織學切片對所有實驗組和對照組肝臟、腎臟進行觀察均未見變性、壞死等病理現象，細胞核完整，核仁清晰可見，胞漿染色正常，無異染物質。

在急性毒性研究中，文獻^［23］中認為HA的半數致死量為13.43g/L。本試驗采用Nano-HA浸提液進行尾靜脈注射、腹腔注射外，考慮到Nano-HA植入后有被吸收入血的可能，附加了Nano-HA混懸液組，發現只有濃度為10mg/mL的Nano-HA混懸液在靜脈注射后24h、48h、72h小鼠體重變化與生理鹽水組對照有顯著差異，注射后1周沒有顯著性差異，腹腔注射各組鼠的體重變化與生理鹽水組都沒有顯著性差異。1周后各組小鼠的肝臟、腎臟在大體觀察時和組織學鏡下觀察均未見異常，說明不同分散處理的Nano-HA不含有害成分，10mg/mL濃度的Nano-HA混懸液雖在短期內可影響小鼠體重變化，但也是安全劑量，與文獻^［24］的研究結果HA-sol的安全劑量9.85g/L相似。