實驗三　溫度對酶活力的影響——最適溫度的測定

一、實驗?zāi)康?/h3>

1.了解溫度對酶活力影響的機(jī)理。

2.掌握測定最適溫度的基本原理。

3.掌握最適溫度測定方法。

二、實驗原理

溫度對酶的影響有雙重作用：一方面，溫度加速酶促反應(yīng)速率；另一方面，酶是蛋白質(zhì)，溫度升高會引起酶蛋白質(zhì)的變性。因此，在較低溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速率隨溫度升高而增大，超過一定溫度后，反應(yīng)速率下降。酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大值時的溫度稱酶促反應(yīng)的最適溫度。如果保持其他反應(yīng)條件恒定，而在一系列變化的溫度下測定酶活力，以溫度為橫坐標(biāo)、反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)作圖，可得到一條溫度-酶活力曲線（圖3-1），從中就可求得最適溫度。

各種酶的最適反應(yīng)溫度是不同的，一般動物組織中各種酶的最適溫度在35～40°C，植物和微生物中各種酶的最適溫度范圍較大，在32～60°C之間。但最適溫度不是酶的特征常數(shù)，一種酶的最適溫度不是一個恒定的數(shù)值，它與反應(yīng)條件有關(guān)。如果反應(yīng)時間延長，一般最適溫度降低。因此，對同一種酶來講，應(yīng)該說明是在什么條件下的最適溫度。

溫度是影響酶促反應(yīng)速率的重要因素之一。在溫度較低時，絕對溫度對vmax的影響遵守Arrnenius公式：

式中，Ea為酶促反應(yīng)的活化能，J/mol；R為氣體常數(shù)，8.314J/（mol·K）；T為絕對溫度，K；vmax為當(dāng)酶全部被過量底物飽和時所測得的反應(yīng)速率。

實驗時，測定不同溫度下酶促最大反應(yīng)速率vmax，以lgvmax對絕對溫度的倒數(shù)1/T作圖，得一斜率為-Ea/2.3R的直線，由此可求得活化能Ea。

三、試劑與器材

1.試劑

（1）酸性磷酸酯酶原酶液（從綠豆芽中提取）。

（2）0.05mol/L檸檬酸緩沖液（pH5.0）。

（3）酸性磷酸酯酶溶液：將原酶液用0.05mol/L pH5.0的檸檬酸緩沖液稀釋25倍左右，使測定的第5管OD405nm值在0.6～0.7之間。

（4）1.2mmol/L NPP：精確稱取NPP 0.4454g，用緩沖液溶解定容至1000mL。

（5）0.3mol/L NaOH溶液。

2.器材

恒溫水浴鍋，可見分光光度計，試管，移液槍，計時器。

四、實驗步驟

1.酶促反應(yīng)

取8支試管，編號，0號管為空白。各管加入1.0mL 1.2mmol/L NPP溶液，另取8支試管加入酶液2mL。酶與底物對應(yīng)在10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、50℃、60℃、70℃恒溫水浴鍋保溫2min。酶液預(yù)熱時間不要超過2min，否則酶易失活，特別是在溫度較高時。預(yù)熱后各管加入酶液1.0mL，精確反應(yīng)15min后，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)。

2.測定OD405nm值

0號管反應(yīng)溫度為50°C，先加入3.0mL 0.3mol/L NaOH溶液后再加入酶液。各管反應(yīng)終止并冷卻后以0號管為空白，測定OD405nm值。

3.數(shù)據(jù)處理

①以反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)、OD405nm（代表反應(yīng)速率）為縱坐標(biāo)，繪制溫度-酶活力曲線，求出酸性磷酸酯酶在此條件下的最適溫度。

②以反應(yīng)絕對溫度的倒數(shù)（1/T）為橫坐標(biāo)、lgOD405nm為縱坐標(biāo)作圖，求出直線部分的斜率，計算酶促反應(yīng)的活化能。

五、注意事項

1.注意酶液預(yù)熱時間不要超過2min，否則酶易失活，特別是在溫度較高時。

2.加入0.3mol/L NaOH溶液終止反應(yīng)時，應(yīng)確保搖晃振動試管，使溶液混合均勻，同時終止反應(yīng)后務(wù)必從水浴鍋中取出試管，室溫存放，及時測定OD值。

六、作業(yè)及思考題

1.繪制溫度-酶活力曲線圖，記錄實驗結(jié)果，計算酸性磷酸酯酶的最適溫度；繪制Arrnenius圖，計算本酶促反應(yīng)的活化能。

2.實驗中如何保證酶反應(yīng)時間的準(zhǔn)確度？