實驗二　pH對酶活力的影響——最適pH的測定

一、實驗目的

1.了解pH對酶活力影響的機理。

2.掌握測定最適pH的基本原理。

3.掌握最適pH測定方法。

二、實驗原理

pH對酶活力的影響極為顯著。酶表現其最高活性時所處的pH即酶的最適pH（圖2-1）。通常各種酶只在一定的pH范圍內才能表現它的活性。一種酶在不同的pH條件下所表現出來的活性不同。

pH之所以對酶活性有很大影響，可能是它改變了酶活性部位有關基團的解離狀態。在最適pH時，酶分子上活性基團的解離狀態最適于酶與底物的結合。而高于或低于最適pH時，酶活性部位基團的解離狀態均不利于酶與底物的結合，酶活力也就相應降低。pH也可影響底物的解離及反應體系中其他組分的解離。緩沖體系中離子的性質和離子強度也可能對酶促反應產生影響。另外，pH除了對酶活性有很大影響外，對酶的穩定性也有影響。過高或過低的pH都會改變酶的活性中心的構象，甚至改變整個酶分子的結構而使其變性失活。

在保持其他反應條件恒定，而在一系列變化的pH下測定酶活力，以pH為橫坐標，OD405nm值為縱坐標作圖，可得到一條pH-酶活力曲線，從中就可求出最適pH。

三、試劑與器材

1.試劑

（1）酸性磷酸酯酶原酶液（從綠豆芽中提取）。

（2）酸性磷酸酯酶溶液：將原酶液用水稀釋10倍左右，使pH-酶活力曲線中第6管OD405nm在0.6～0.7之間。

（3）2.4mmol/L NPP水溶液：精確稱取NPP 0.8908g，用水溶解并定容至1000mL。

（4）0.3mol/L NaOH溶液。

2.器材

恒溫水浴鍋，可見分光光度計，試管，移液槍，計時器。

四、實驗步驟

1.酶促反應

取11支試管編號，0號為空白。各加入2.4mol/L NPP 0.2mL，相應加入不同緩沖液各1.8mL，每管再各加入35°C預保溫（另取2支試管，各加入稀釋好的酶液5～6mL，于35°C恒溫水浴鍋中保溫2min）的酶液1mL，立即搖勻計時，15min后加入2.0mL 0.3mol/L NaOH溶液終止反應。

2.測定OD405nm值

0號管先加入2.0mL 0.3mol/L NaOH溶液后再加入酶液，各管終止并冷卻后測OD405nm，將結果按不同pH對應記錄。

3.數據處理

以反應pH為橫坐標、OD405nm為縱坐標，繪制pH-酶活力曲線，求出酸性磷酸酯酶的最適pH。

五、注意事項

1.注意加入酶液后立即搖勻計時。

2.加入0.3mol/L NaOH溶液終止反應時，應確保搖晃振動試管，使溶液混合均勻，同時終止反應后務必從水浴鍋中取出試管，室溫存放，及時測定OD值。

六、作業及思考題

1.繪出pH-酶活力曲線圖，記錄實驗結果，計算酸性磷酸酯酶的最適pH。

2.pH值影響酶催化的機理是什么？