實驗四　米氏常數和最大反應速率的測定

一、實驗目的

1.了解米氏方程的含義及其重要意義。

2.掌握測定米氏常數（Km）和最大反應速率（vmax）的基本原理。

3.掌握Km和vmax的測定方法。

二、實驗原理

在溫度、pH和酶濃度恒定的條件下，底物濃度對酶促反應的速率有很大影響（圖4-1）。在底物濃度很低時，酶促反應速率（v）隨底物濃度的增加而迅速增加；隨著底物濃度繼續增加，反應速率的增加開始減慢；當底物濃度增加到某種程度時，反應速率達到一個極限值（vmax）。

底物濃度與反應速率的這種關系可用米氏方程表示：

式中，v為反應速率；Km為米氏常數；vmax為酶促反應最大速率；［S］為底物濃度。

從米氏方程可見，米氏常數Km等于反應速率達到最大反應速率一半時的底物濃度，米氏常數的單位就是濃度單位（mol/L或mmol/L）。在酶學分析中，Km是酶促反應的一個基本特征常數，它包含著酶與底物結合和解離的性質。Km與底物濃度、酶濃度無關，與pH、溫度、離子強度等因素有關。對于每一個酶促反應，在一定條件下都有其特定的Km值，因此可用于鑒別酶。測定Km、vmax一般用作圖法。作圖法有很多種，最常用的是Linewaver-Burk作圖法，該法是根據米氏方程的倒數形式，以1/v對1/［S］作圖，可得到一條直線。直線在橫軸上的截距為-1/Km，縱軸截距為1/vmax，可求出Km與vmax（圖4-2）。

三、試劑與器材

1.試劑

（1）酸性磷酸酯酶原酶液（從綠豆芽中提取）。

（2）0.05mol/L檸檬酸緩沖液（pH5.0）。

（3）酸性磷酸酯酶溶液： 將原酶液用0.05mol/L pH5.0的檸檬酸緩沖液稀釋25倍左右，使測定的第5號管OD405nm在0.6～0.7之間。

（4）1.2mmol/L NPP溶液：稱取NPP 0.4454g，用緩沖液溶解并定容至1000mL。

（5）0.3mol/L NaOH溶液。

2.器材

恒溫水浴鍋，可見分光光度計，試管，移液槍，計時器。

四、實驗步驟

1.酶促反應

取10支試管按表4-1編號。1～5號管加入各不相同的底物濃度樣品，并設空白管。各空白管在加入NPP和緩沖液后，先加入0.3mol/L NaOH溶液，再加入酶液。其余各管按表4-1操作。精確反應15min后，各管加入0.3mol/L NaOH溶液終止反應。

2.測定OD405nm值

終止各管反應，待冷卻后以1～5號管中相應底物濃度作空白，在可見分光光度計上測定OD405nm值。

3.數據處理

通過測定，得到一組數據OD405nm，由于酶促反應產物對硝基鹽離子在0.1～0.2mol/L NaOH溶液中，在405nm處的摩爾消光系數為18.8×103，則OD405nm值與反應速率的換算為：

式中，OD405nm為每管測定光密度值；t為反應時間，min。

反應液中底物濃度換算式：

式中，X為底物加入量，mL；3指反應液體積，mL；M為加入時的底物濃度，mmol/L。

通過計算求得［S］、v、1/［S］、1/v等值，然后作雙倒數圖，獲取縱、橫截距，求出Km和vmax值。

五、注意事項

注意精確反應15min后，加入0.3mol/L NaOH溶液終止反應時，應確保搖晃振動試管，使溶液混合均勻。

六、作業及思考題

1.繪制1/v-1/［S］直線圖，計算Km和vmax值。

2.最大反應速率的確定有何意義？