第一部分　酶學基礎實驗

實驗一　酶促反應中初速度時間范圍測定

一、實驗目的

1.了解酶促反應中初速度時間范圍測定的基本原理。

2.掌握酶促反應中初速度時間范圍的測定方法。

二、實驗原理

酸性磷酸酯酶（acid phosphatase， EC 3.1.3.2）廣泛分布于動植物體中，尤其是植物的種子、動物肝臟和人體的前列腺中。它對生物體內核苷酸、磷蛋白和磷脂的代謝起著重要作用。

酸性磷酸酯酶能專一性水解磷酸單酯鍵。以人工合成的對硝基苯磷酸酯（4-nitrophenyl phosphate， NPP）作底物，水解產生對硝基苯酚和磷酸；在堿性溶液中，對硝基酚的鹽離子于405nm處光吸收強烈，而底物沒有這種特性（圖1-1）。

利用產物的這種特性，可以定量測定產物的生成量，從而求得酶的活力單位。即通過測定單位時間內405nm處光密度值的變化來確定酸性磷酸酯酶的活性。

酸性磷酸酯酶的1個活力單位是指在酶反應的最適條件下，每分鐘生成1μmol產物所需的酶量。

要進行酶活力測定，首先要確定酶反應時間。而酶的反應時間應該在初速度時間范圍內選擇。可以通過制作進程曲線來求出酶的初速度時間范圍。進程曲線是指在酶反應的最適條件下，采用每隔一定時間測定產物生成量，以酶反應時間為橫坐標、產物生成量為縱坐標繪制而成（圖1-2）。從進程曲線可知，在曲線起始的一段時間內為直線，其斜率代表初速度。隨著反應時間的延長，曲線趨于平坦，斜率變小，反應速度下降。要真實反映出酶活力大小，就應在初速度時間內測定。

三、試劑與器材

1.試劑

（1）酸性磷酸酯酶原酶液（從綠豆芽中提取）。

（2）0.05mol/L檸檬酸緩沖液（pH5.0）：①A液（0.05mol/L檸檬酸），稱取C6H8O7·H2O 10.51g，用蒸餾水溶解并定容至1L；②B液（0.05mol/L檸檬酸鈉），稱取Na3C6H8O7·2H2O 14.7g，用蒸餾水溶解并定容至1L；③取A液35mL與B液65mL混勻，即為0.05mol/L pH5.0檸檬酸緩沖液。

（3）酸性磷酸酯酶溶液（通過原酶液稀釋得到）：取原酶液，用0.05mol/LpH5.0檸檬酸鹽緩沖液稀釋，使進程曲線中第11號管光密度OD405nm在0.6～0.7之間。

（4）1.2mmol/L對硝基苯磷酸酯（NPP）溶液：精確稱取NPP 0.4454g，加緩沖液定容至100mL。

（5）0.3mol/L NaOH溶液。

2.器材

研缽，紗布，透析袋，恒溫水浴鍋，電子天平，可見分光光度計，試管，移液槍，離心機，計時器。

四、實驗步驟

1.酸性磷酸酯酶原酶液的制備

稱取一定重量的綠豆，浸泡24h，在25～30°C溫箱中培養5～7d。長出的豆芽取其莖部，依次用自來水和重蒸水沖洗干凈，置濾紙上吸干水分，稱30g放入研缽中勻漿，加0.2mol/L醋酸鹽緩沖液4mL，置4°C冰箱中6h以上。然后用雙層紗布擠壓過濾，濾液6000r/min離心15min，上清液置透析袋用蒸餾水充分透析，間隔換水10次，透析24h以上。將透析后的酶液稀釋至最終體積與豆芽質量（g）相等，以6000r/min離心30min，所得上清液即為原酶液，置冰箱待用。

2.酶促反應

取試管12支，按表1-1編號，0號為空白。各管加入1.0mL 1.2mol/L NPP溶液；另外取2支試管，各加入稀釋好的酶液7mL，在酶反應前底物與酶都放入35°C恒溫水浴鍋中預熱2min。然后向1～11號管內各加入1.0mL預熱的酶液。立即搖勻并開始計時。按時間間隔為3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min進行反應。待反應進行到上述各相應時間時，加入3.0mL 0.3mol/L NaOH溶液終止反應。冷卻后以0號管作空白（0號管加入1.0mL NPP溶液后保溫25min，然后加入3.0mL 0.3mol/L NaOH溶液，再加入1.0mL酶液），在可見分光光度計上測定各管OD405nm值。

3.數據處理

以反應時間為橫坐標，OD405nm值為縱坐標繪制進程曲線。由進程曲線中直線部分求出酸性磷酸酯酶反應初速度的時間范圍。

五、注意事項

1.注意加入酶液后要立即搖勻并計時。

2.加入0.3mol/L NaOH終止反應時，應確保搖晃振動試管，使溶液混合均勻，同時終止反應后務必從水浴鍋中取出試管，室溫存放，及時測定OD值。

六、作業及思考題

1.繪出酶促反應進程曲線，記錄實驗結果，計算酸性磷酸酯酶反應初速度的時間范圍。

2.本實驗如果需要測定酸性磷酸酯酶的活性，還需要補做什么實驗？