第三節　糖化發酵劑制備

一、糖化劑及糖化工藝

（一）糖化劑的類型

淀粉質原料釀制食醋，必須經過糖化、酒精發酵、醋酸發酵3個生化階段。把淀粉轉變成可發酵性糖，所用的催化劑稱為糖化劑。食醋生產采用的糖化劑，現在基本有以下6個類型。

1.大曲（曲塊）

大曲是以根霉、毛霉、曲霉、酵母為主，并有大量野生菌的糖化曲。大曲主要是利用霉菌產生的淀粉酶對淀粉進行水解，與成曲之后霉菌的死活沒有多大關系，但也保留少量活的細菌和酵母。生產時非常強調用陳曲，一般要求存放半年以上。這類曲生產工藝復雜，但優點是便于保管和運輸，釀成的食醋風味好，但淀粉利用率較低，生產周期長，現在我國幾種主要名特食醋的生產仍多采用大曲。

2.麩曲（散曲以黑曲霉、黃曲霉為主）

麩曲為國內釀醋廠所普遍采用的糖化劑。糖化力強，出醋率高，采用人工純培養，操作簡便。麩曲生產成本低，對各種原料適應性強，制曲周期也短。老法制醋所用的大曲、麥曲、藥曲等都是利用空氣中、工具及覆蓋物上存在的微生物，在原料上自然繁殖而成，由于菌種來源極其不純，成曲質量差異很大，使產品質量不夠穩定，原料利用率低。1970年以前北京市制醋行業大部分使用北京市龍門醋廠制曲車間生產的大曲，每年制曲耗用糧近百萬斤（大麥、豌豆）。1971年推廣應用黑曲霉麩曲并停止了大曲的生產，不僅節約了制曲用糧，而且提高了醋的出品率20%左右。由于麩曲酶系較大曲單純，故在產品風味和澄清程度上還有一定的差距。

3.小曲

小曲又稱酒藥、藥曲或藥餅，是我國獨特的釀酒釀醋糖化發酵劑。主要是根霉及酵母，利用根霉在生長過程中所產生的淀粉酶以進行糖化作用。小曲釀醋時，用量很少。小曲便于運輸和保管，但這類曲對原料選擇性強，適用于糯米、大米、高粱等原料，對于薯類及野生植物原料的適應性差。

4.紅曲

紅曲是我國特產之一，紅曲霉培養在米飯上能分泌出紅色素與黃色素，而且有較強的糖化酶活力，被廣泛應用于增色及紅曲醋、烏衣紅曲醋的釀造。

5.液體曲

一般以曲霉菌為主，經發酵罐內深層培養，得到一種液態的含α-淀粉酶及糖化酶的曲子，可代替固體曲用于釀醋。液體曲生產的菌種是在液體培養基中生長快、糖化力強的菌株，一般固體曲用的菌種不一定適合在液體中培養。液體曲常用的菌種有UV-11等。液體曲生產機械化程度高，能節約勞動力，降低勞動強度，但設備投資大，動力消耗大，技術要求高。

6.糖化酶

主要以深層培養法生產提取酶制劑，如用于淀粉液化的枯草芽孢桿菌α-淀粉酶及用于糖化的葡萄糖淀粉酶都可加工成酶制劑，用于食醋釀造。

在糖化酶品種的選擇上，傳統的固態發酵工藝以酶代曲，可以選擇固體糖化酶；在間歇糖化時，固體或液體糖化酶可以直接加入糖化鍋，不必稀釋；在連續糖化時，可先用30℃溫水稀釋糖化酶后進行流加。液體糖化酶由于濃縮倍數高、活力高、酶系純、雜質少，使用效果優于固體糖化酶；復合糖化酶由于進一步提高了最終成品醋的收得率，因此，比普通糖化酶有著更好的效果。

（二）制曲

1.大曲生產

（1）大曲生產工藝流程　制大曲工藝流程見圖2-2。

（2）生產要點

① 原料粉碎　將大麥70%與豌豆30%混合后分別粉碎。過20目孔篩，通過孔篩的細粉與通不過孔篩的粗粉之比，夏季為30∶70，冬季為20∶80。

② 拌料踩曲　拌料要均勻，掌握好水分，每50kg混合料加溫水25kg。踩曲用12人依次踩實。不少廠家已采用機械制曲機制曲，踩好的曲塊應厚薄均勻、外形平整、四角飽滿無缺、結實堅固，每塊曲3.5kg。

③ 入曲室　將制成的曲坯搬入室溫25℃左右的曲房內，地面先鋪墊一層谷糠，曲坯立放，間距1～2cm，行距3～4cm；再碼放曲坯一層，層間用葦稈架隔，間距、行距同第一層。用葦席1～2層遮蓋坯垛，并在葦席上噴灑清水，使其潮濕。

④ 上霉　關閉曲房門窗，讓曲坯自然升溫，當坯表面均勻生長有白色小菌落時，上霉完成。上霉時間48～72h。

⑤ 晾霉　晾霉指在降溫、排潮下，曲坯表面霉點受涼并定型。

打開曲房門窗，揭開葦席，經12h左右，將曲坯翻碼為三層，間距擴大為3～4cm，品溫要求不超過33℃；再經12h左右，當品溫升至36～37℃時，將曲坯翻碼為四層，間距擴大為5cm左右，以后經24h曲坯翻碼一次。晾霉時間為48～72h。

⑥ 起潮火　起潮火指微生物大量生長繁殖，使曲坯排放的水汽最多，品溫很高的階段。

關閉曲房門窗，品溫自然上升。用開閉門窗、翻碼曲坯、擴大間距、增加碼層等方法，控制品溫在38～47℃，時間為4天左右。

⑦ 大火　大火指微生物繼續生長繁殖，使曲坯品溫達到最高峰的階段。

每1～2天翻碼曲坯一次，間距10cm以上，要求品溫為30～48℃，時間為7～8天。此期間曲的水分基本排除干凈。

⑧ 后火　后火指微生物生長繁殖減慢，曲坯品溫逐漸下降的階段。

大火后，品溫逐漸下降，當降至36～37℃時，翻碼曲坯一次，間距縮小至5cm左右，經3天左右，品溫降至32～33℃。

⑨ 養曲　翻碼曲坯，間距縮小至3.5cm，品溫控制在28～30℃，室溫為30～32℃，時間2～3天。

⑩ 成曲貯存　打開門窗，經3～5天晾曲后，移入干燥、陰涼、通風的庫房內貯存，成曲間距1cm以上，碼層不超過6層，以防返火。如制紅心曲，則應在曲將成之日，保溫坐火，使曲皮兩邊向中心夾擊，兩邊溫度相碰接火，則紅心即成。

2.麩曲生產

固體麩曲的生產方法通常有曲盒制曲、簾子制曲和機械通風制曲3種。制盒曲、簾子曲勞動強度大，目前只有制作種曲時或小廠采用，大生產中已被淘汰了。簾子制曲雖然有一定改進，但仍不能擺脫手工操作，勞動強度大而且占用廠房面積大，生產效率低，還受氣候影響，產品質量不穩定，通常只有制備種曲時應用此法。機械通風制曲，曲料厚度為簾子法的10～15倍，曲料入箱后通入一定溫度、濕度的空氣，提供曲霉適宜生長的條件，這樣便可達到優質、高產及降低勞動強度的目的。

（1）麩曲的生產工藝流程　麩曲的生產工藝流程見圖2-3。

（2）生產要點

① 試管培養（龍門醋廠AS3.758黑曲霉曲生產工藝）　稱大米50g，沖洗干凈，加入350mL水煮成飯狀，降溫至50～55℃接入新鮮的黑曲霉20g，放入500mL三角瓶中，蓋上棉塞，在50～55℃水浴鍋保溫糖化4h，取出用脫脂棉過濾，再用濾紙過濾1次即為糖化液，100mL糖化液加入瓊脂2～3g，溶化后裝入試管，高壓滅菌0.1MPa、20min，取出做成斜面培養基，放入冰箱備用。

在無菌條件下接種，置于30℃保溫箱72h后，長滿黑褐色孢子即可應用。

② 三角瓶培養　稱取麩皮100g，稻殼5g，加水75～80mL，拌勻裝入1L三角瓶中，厚0.5～1cm，加棉塞，包好防潮紙，高壓滅菌（0.1MPa、15min）后取出放入無菌室冷卻至30℃，將試管中黑曲霉移接在三角瓶中，置于30℃保溫箱中培養，經24～28h觀察生長情況，如布滿白色菌絲，即可扣瓶。將三角瓶倒放在保溫箱中，再經48h，等長滿黑褐色孢子即成熟，短期備用。

③ 木盒種曲培養　稱取麩皮50kg，加水50～55kg，拌勻，裝鍋，冒汽后40min取出，在無菌培養室過篩疏松，等品溫降到35℃左右，種曲[0.3%～0.5%（質量分數）]接入三角瓶。接種后品溫降至30～32℃，堆集1～2h，然后裝入滅菌的曲盒內，厚度1cm左右，碼成柱形，前期室溫29℃，當品溫上升到34～35℃時倒盒，等長滿菌絲后將盒內曲料分成小塊，即劃盒。劃盒后將曲料攤平，蓋上滅過菌的濕草簾，然后將盒擺成品字形。地面上灑些水，以保持室內濕度。中期室溫保持在26℃，全部生產過程需72h，待曲料布滿黑褐色孢子即種曲成熟。后期室溫控制在30℃，排除曲房潮氣，存放在陰涼、空氣流動處，干燥備用。

④ 通風制曲　由于曲料厚度在20～25cm，要求通風均勻，阻力小，因此在配料中適當加入稻殼或谷糠等以保證料層疏松。

每50kg麩皮加入稻殼4～5kg，加水30～32.5kg拌勻，裝入鍋內，冒汽30min出鍋，用揚料機打碎結塊并降溫，至32～35℃接種曲[0.3%～0.5%（質量分數）]，裝入曲池內，品溫30℃，室溫保持在28℃左右，品溫上升至34℃時開始通風，降至30℃時停風，待曲塊形成翻曲1次，疏松曲塊利于通風，連續通風控制品溫，經28～30h菌絲大量結塊，即成麩曲，出曲室攤開陰干，短期備用。

3.小曲生產

小曲以大米、大麥等為原料，有的添加各種中草藥。在加中草藥問題上各施各法，有的添加一種，有的添加許多種，但生產實踐證明，少用藥或不用藥，也能制得質量較好的小曲。一般采用經過長期自然培養的種曲進行接種，也有用純粹培養根霉和酵母菌進行接種，這樣更能保證有用微生物的大量繁殖。

曲霉等。

（1）小曲生產工藝流程　以無藥糠曲為例介紹，生產工藝流程見圖2-4。

（2）生產要點

① 原料處理　先把碎米碾成米粉，再用少量冷水將所需米粉泡濕，然后將此米粉傾入鍋內的沸水中，不等煮得過熟即取出。純糠也碾碎，在純糠碾到最后一次時加曲種共同碾碎。

配料比例：純糠87%～92%，碎米粉5%～10%，曲種3%，加水量為原料的64%～70%。

② 制坯　先在攪拌場將曲母、碎米粉、純糠粉按比例拌和均勻，拌勻后再過秤裝入拌料盒。摻水時邊摻邊和，要和得快，和得散，和得均勻，和3～4遍，要求達到無生粉、無疙瘩，并仔細檢驗水分。踩坯要踩干，用切刀按緊壓平，切成3.7m3的曲塊。切曲要切斷，團曲要無棱角，表面光滑，要達到曲皮光潤、保持水分并有松心緊皮的效果，以利于霉菌生長勻壯。團曲每100kg撒粉0.3kg（在3%曲母中扣出），要撒布均勻。當天拌好的原料必須當天用完，絕對不能剩到第二天使用。工具要清洗。團曲成型后送入曲室，由上而下，由邊角至中央擺放，曲與曲的間隔保持不靠攏即可。

③ 培養曲　根據小曲中微生物的生長過程，大致可分為三個階段進行管理。

前期培養：小曲入室，室溫保持22～26℃，經10～12h，品溫升至27～28℃，曲粒生香味，菌絲稍露，開窗放濕。至20h開始出現甜香，即轉入中期培養。

中期培養：20h后，品溫升到35～36℃，曲粒甜香，有白霜。25～40h后曲粒品溫由37～39℃降至28～29℃，這時要排潮，使品溫提高到30～32℃，轉入后期培養。

后期培養：45h后，室溫控制在33℃以上，為高溫排潮期。70h后即可出曲。

品溫以中層的曲心為標準，室溫溫度表應懸于中層中間。

成品率一般為原料的80%～84%。

出曲后將曲室打掃干凈，每月用硫黃或甲醛將曲室滅菌1～2次。

④ 烘干　曲粒出房后，立即移至烘房，在低溫下進行烘干或曬干，至水分11%以下，保藏備用。

4.紅曲生產

紅曲生產工藝流程見圖2-5。

① 菌種

試管斜面培養：10.5%～14.5%的飴糖液100mL，可溶性淀粉5g，蛋白胨3g，瓊脂3g，加熱溶解后，加入冰醋酸0.2%，分裝入試管，殺菌后制成斜面。接入紅曲霉試管原種，置于恒溫箱內28～30℃，培養14～20天備用。

米試管培養：試管中裝入蒸熟的秈米（1/4體積），殺菌后冷卻至室溫接種（用經過殺菌的0.2%稀醋酸5～10mL，洗斜面紅曲種子中的菌體，再用無菌吸管吸取0.5mL的紅曲種子，接入大米試管中搖勻），在30～34℃恒溫箱中培養10～14天后備用。

② 紅曲用料配比　每100kg秈米加冷開水7kg，冰醋酸120～150g，紅曲米試管菌種3支。使用前將紅曲米試管菌種研細并與冷開水及冰醋酸混合均勻。

③ 秈米處理及接種　秈米加水浸泡40min，淘洗后瀝干，再倒入蒸桶內蒸飯，邊開蒸汽邊上蒸，等到蒸桶周圍全部冒汽后，加蓋再蒸3min。蒸好的飯移入木盤內，搓散結塊并散熱，冷卻到42～44℃（不得超46℃），接入已混合冰醋酸液的研細紅曲種子，充分拌和后裝入麻袋，把口扎好，進入曲室培養。

④ 培養　進入曲室時，品溫開始由原來的36℃下降到34℃，而后慢慢上升，從34℃上升至39℃，需17～19h。以后每1h能升溫1℃，到最后每0.5h即可升溫1℃，待升至50～51℃時立即拆開米飯包，移至備有長形固定木盤的曲室中。整個過程所需時間為24h，此時曲室溫度自始至終保持在25～30℃。當米飯拆包攤至木盤時已有白色菌絲著生，漸漸散熱冷卻到36～38℃時，再把米飯堆集起來（上面蓋有麻袋以利保溫），使溫度上升至48℃。一般從51℃經冷卻后上升到48℃，需5～6h。堆集達到48℃時，再把米飯散開來，翻拌冷到36～38℃，再次把米飯堆集起來，使溫度上升到46℃，約需2h。料溫達到46℃時第二次把米飯攤開，翻拌冷卻至36～38℃。第三次把米飯堆集起來，再使溫度上升到44℃時，最后把它散開來用板刮平。這時米飯粒表面已染成淡紅色，使品溫正常保持在35～42℃，不得超過42℃，一直保持到浸藍為止。

⑤ 浸曲　培養35h左右，當米飯大部分已成淡紅色，且十分干燥時需要進行浸曲。以后每隔6h浸曲吃水一次，即把木盤內的曲裝入淘米籮內，放進小缸浸曲約1min后取出淋干，再倒入木盤內刮平。浸曲水溫要求在25℃左右。如此進行浸曲吃水七次，浸曲前4h要翻拌一次，浸曲后也要翻拌一次。從米飯培養到出曲共計4天，使成品外觀全部呈紫紅色。為了降低勞動強度，可以不進行浸曲，而實行直接加水的操作，每100kg米每次吃水7～12kg。

⑥ 烘干　將濕曲攤入盛器內，厚度約1cm以下，進入烘房進行干燥。干燥溫度為75℃左右，干燥時間為12～14h。每l00kg秈米得紅曲成品38kg左右。

5.液體曲生產

（1）液體曲生產工藝流程　液體曲生產工藝流程見圖2-6。

（2）生產要點

① 孢子懸浮液的制備

斜面菌種的制作：以UV-11菌種為例。液體菌種要求孢子多，宜采用營養豐富的小米或米曲汁為培養基。

小米培養基及生產菌種的培養過程：先將優質小米洗凈，加入15%～20%麩皮，再按1∶1.2的加水量加水后，常壓蒸30min；然后分裝試管，每支裝3～5g，做成斜面，在0.15MPa的蒸汽壓力下，殺菌60min，冷卻接種；再放入恒溫箱中30～32℃培養5～7天，培養前2～3天是菌絲生長期，后2～3天生長孢子，直到孢子布滿整個斜面。

孢子懸浮液的制備：用無菌水把培養的斜面菌種的孢子洗下，做成孢子懸浮液，置于冰箱中備用。

② 種子培養

培養基的配制：種子培養基與液體曲培養基的配方原則上應有區別，但生產上為了管理方便，不單獨配制種子培養基，而是采用液體曲培養基。其配方是：薯干粉5.2%，米糠2%，豆餅粉1.2%，硫酸銨0.16%。

培養基的滅菌：由于培養基使用麩皮、米糠、豆餅粉等蛋白質含量高的原料，故殺菌要徹底，否則容易發生雜菌污染。此外培養基在高溫殺菌的過程中也使原料中淀粉溶解，蛋白質變性。

生產上采用間斷性配料和連續配料的方法時宜設置兩臺配料機。在配料罐中將料液攪拌均勻后用鹽酸調pH值到4.5，再將料液加熱到85℃，經往復泵送入兩套管加熱器中，在器內通入0.45MPa的直接蒸汽，將料液加熱到135℃左右，然后進入第一后熱器，再進入第二后熱器，在后熱器中總時間為40～45min，最后經噴淋冷卻器冷卻至30℃，再進入種子罐或培養罐。

種子培養：先將種子罐進行空罐滅菌。其方法是先將種子罐洗凈，排凈罐內和夾層內的存水，用高壓蒸汽滅菌，保持罐壓0.15MPa，時間為20min。待罐壓降至“0”開始投料。投料完畢，用微孔針刺法，利用突然減壓把孢子懸浮液接種到種子罐中，接種量為5%～10%。接種前后均保持罐內壓力為0.03MPa，培養溫度30～32℃。培養過程需通入無菌空氣，風量為1∶0.4（1m3醪液、1min通入0.4m3空氣）。培養時間一般為36～40h。

③ 成品曲制備　利用壓力差將種子罐中培養好的種子液壓入培養罐中，即提高種子罐壓力，同時適當降低培養罐壓力，造成壓力差，將種子液從種子罐壓入培養罐。接種量為10%左右，維持罐壓力0.05MPa，通風量為1∶0.2，溫度為30～32℃，培養40h后每隔2h取樣測定酶活力和pH值，直至酶活力開始下降，即可放罐，一般需三天左右。

液體曲成熟后暫不使用時，可在低溫26～27℃、保壓條件下貯存一周之久。在貯存期間雖會由于菌體自溶而使液體變稀，但酶活力仍保持不變。

（三）糖化工藝

1.高溫糖化法

高溫糖化法也叫酶法液化法，是以α-淀粉酶制劑對原料進行液化，再用液體曲或固體曲進行糖化的方法。由于液化和糖化都在高溫下進行，所以叫高溫糖化法。這種方法具有糖化速度快、淀粉利用率高等優點，廣泛用于液體深層制醋和回流法制醋等新工藝。

（1）液化工藝　將淀粉乳濃度調到16°Bé以上，用純堿調整pH值到6.2～6.4，加入適量的氯化鈣（Ca2+有提高淀粉酶的熱穩定性作用），其用量為原料的0.1%。按要求投入定量的液化酶（生產上控制5～8U/g原料），攪拌均勻后，送到液化及糖化桶中，加熱到85～90℃，保溫10～15min，至DE值（葡萄糖值，糖化液中還原糖全部當作葡萄糖計算，占干物質的百分率稱為葡萄糖值，它表示淀粉的水解程度或糖化程度）為15左右。然后升溫至100℃滅酶5～10min。

（2）糖化工藝　用冷開水把醪液降溫至65℃，加入固體曲或液體曲，用量為100～120U/g原料，糖化時的pH值控制在4.0～4.6，糖化時間為30min左右。糖化后，應立即冷卻到30℃，送入酒精發酵工段。

在液化和糖化過程中，都需要攪拌操作。液化及糖化設備見圖2-7。

2.傳統工藝法

傳統的制醋方法，無論是蒸料或煮料，其糖化工藝的共同特點如下。

（1）不進行人工培養糖化菌，而是依靠自然菌種進行糖化，因此酶系復雜，糖化產物繁多，為各種食醋提供獨特風味。

（2）糖化過程中液化和糖化兩個階段并無明顯區分。

（3）糖化和發酵同時進行，有的工藝甚至進行糖化、酒精發酵、醋酸發酵三邊發酵。

（4）糖化過程中產酸較多，原料利用率低。

（5）糖化時間一般為5～7天。

目前，各地對傳統工藝都有所改進。現多用純種培養的黑曲霉制麩曲進行糖化，以利提高糖化率。

3.生料糖化法

生料糖化法就是淀粉質原料預先不經過蒸煮，直接用糖化劑對原料淀粉進行糖化。此法可節約能源20%～30%，省去潤料、蒸煮、冷卻等工序。但是，要做到淀粉水解率不低于熟料糖化法，首先就需要擁有對生淀粉水解率高的微生物菌種，這是十分關鍵的；另外，用曲量要適當增大；其次，生料糖化產生出來的糖要能迅速被酵母菌利用，始終讓發酵醪中的可發酵性糖保持在2%左右的低水平，借助酵母菌的生長優勢以及生成的酒精和各種有機酸來抑制雜菌的生長繁殖，保證發酵正常進行。關于生料糖化法，國內外學者進行過許多研究，特別是用在酒精發酵上，由于全世界酒精生產數量十分巨大，如果生料糖化法可替代熟料糖化法，它將產生出巨大的經濟效益。

隨著酶學的研究的不斷深入發展，通過對酶進行分離、純化及特性研究，已弄清生料糖化的實質是真菌葡萄糖淀粉酶對生淀粉的降解作用。葡萄糖淀粉酶對不同種類的生淀粉的水解效果是不同的。有實驗表明，黑曲對玉米生淀粉的水解率最高，而對馬鈴薯生淀粉的水解最差。

二、酒母的制備

使糖液或糖化醪進行酒精發酵的原動力是酵母菌。將純種酵母菌經過逐級擴大化培養制成的酵母培養液稱為酒母。

在自然界中，酵母菌的種類很多，有些酵母菌能發酵糖生成酒精，有些則不能；有的生成酒精能力強，有的則弱；有的酵母菌能產生酯類物質，有的就沒有這種能力；有的酵母菌在不良環境中仍能進行發酵，有的則適應能力差。用傳統工藝釀醋，在醋生成之前的酒精發酵是依靠曲中以及空氣中落入物料中的酵母菌繁殖后進行的。由于依靠自然界的酵母菌，菌種會有不同，功能也各異，使食醋風味好、口味醇厚，但質量就不易保持穩定，且原料出醋率低，有的每100kg糧食僅出醋0.3kg。新的釀醋方法，由于采用優良酵母菌菌種，通過純培養方法制成酒母，再將其接入糖化醪或醅中進行酒精發酵，因此生產效率大為提高，產品質量穩定，出醋率上升。制備酒母時應選擇產酒率高、發酵迅速、抗雜菌能力強、對環境適應性好、性能穩定的優良菌株。

酒母的擴大培養過程主要包括斜面試管、液體試管、小（大）三角瓶、卡氏罐、酒母罐（缸）等培養步驟。

1.酒母擴大培養

酒母擴大培養流程見圖2-8。

2.工藝要點

（1）試管斜面菌種　用麥芽汁或米曲汁糖化液制成斜面培養基。接種酵母原菌，在28℃培養3天即得。保存于4℃冰箱中，1～3個月移接一次。

（2）小三角瓶擴大培養　用7°Bé麥芽汁或7°Bé米曲汁，于250mL三角瓶中裝入150mL培養基，滅菌冷卻后，接種斜面菌種1～2環，搖勻后于28℃下培養24h。

（3）大三角瓶培養　麥芽汁或糖化醪500mL裝入1000mL三角瓶中，滅菌并冷卻至30℃左右，接入小三角瓶酒母液約25mL，在28℃下培養16～20h。

（4）卡氏罐培養　容量一般為15L的不銹鋼卡氏罐（如圖2-9所示），加入稀釋到14%～16%的經硫酸調pH值至4.1～4.4的糖化醪，滅菌后冷卻到25～30℃，接入大三角瓶酒母液，在28℃左右培養10～18h。

（5）酒母罐擴大培養　按生產實際需要，可選擇大缸或發酵罐進行酒母的再擴大。培養基多用玉米糖化醪，接入卡氏罐酵母，在30℃條件下保溫培養8～9h，即達成熟。

三、醋母制備

傳統方法制醋，是依靠野生醋酸菌自然進入醋醅進行醋酸發酵，因此，生產周期長、出醋率低。現在多使用人工選育的優良醋酸菌，通過擴大培養得到醋酸菌種子（醋母），再將其接入醋醅或醋醪中進行醋酸發酵，使生產效率大為提高。

（一）菌種的選擇、培養及保藏

1.菌種的選擇

醋酸菌能氧化酒精為醋酸，但不同的醋酸菌其氧化能力不同，產生風味物質的多少也有很大差別，所以選擇菌種很重要。AS 1.41醋酸菌和滬釀1.01醋酸菌是常用的釀醋優良菌株。

2.醋酸菌的培養及保藏

（1）培養基　試管斜面培養基。

① 酒精含量6%的酒液100mL，葡萄糖0.3g，酵母膏1g，瓊脂2.5g，碳酸鈣1.5g，水100mL。

② 酒精2mL，葡萄糖1g，酵母膏1g，瓊脂2.5g，碳酸鈣1.5g，水100mL。

以上兩種培養基中任選一種，不必調節pH值，制成試管斜面備用。

（2）培養方法　斜面接種醋酸菌后，置于30～32℃培養箱中培養48h。

（3）保藏　醋酸菌易被自己所產生的酸殺死，特別是能產酯的菌種在室溫下十幾天就死亡，因此斜面菌種宜保藏在4℃冰箱中，培養基中加入碳酸鈣可以中和醋酸菌產生的酸，有利于保藏時間延長。

（二）醋酸菌固態法擴大培養

醋酸菌固態法擴大培養，是先將純種醋酸菌經三角瓶擴大培養后，得到的種子液接入到醋醅上，利用自然通風和醋汁回澆的方法進行固態擴大培養。用固態法培養的醋酸菌，因為不是在嚴格的無菌條件下培養，所以純度不高，但已能適用于除液體深層發酵制醋外的各種食醋的釀造。

1.大三角瓶純種擴大培養

在1000mL三角瓶中裝入含酵母膏1%和葡萄糖0.3%的培養液100mL，加棉塞，在98kPa蒸汽壓下滅菌30min。冷卻后，在無菌室內往培養液中加入酒精4%（體積分數），然后接入醋酸菌斜面種子，搖勻后于30℃下靜置培養5～7天。當培養基液面上出現菌膜，有醋酸味，即培養成熟。如用振蕩培養，三角瓶的裝液量可增加至150mL，培養時間可縮短到24h。

2.固態育種

取生產上配制的新鮮醋醅，置于設有假底、下面開洞加塞的大缸中，接入經三角瓶培養成熟的純醋酸菌種子液，拌和均勻。接種量為原料的2%～3%。培養1～2天后，由于醋酸菌繁殖，使品溫升高，此時采用回澆法降溫，即將缸底醋汁放出回澆在醋醅上，控制品溫不高于38℃，繼續培養。經過4～5天的培養，當醋汁酸度達到4g/100mL時，說明醋酸菌已大量繁殖，即可將此醋醅作為醋酸菌種子應用于生產中。

（三）醋酸菌種子液態培養

在種子罐中經液態培養的醋酸菌種子液，一般用于液體深層發酵法制醋。種子罐用不銹鋼罐或陶瓷耐酸罐。

1.一級種子培養

（1）培養基　葡萄糖1%，酵母膏1%，碳酸鈣1.5%，酒精2%。

（2）培養方法　在1000mL三角瓶中裝培養液150mL，于98kPa蒸汽壓下滅菌30min，冷卻后在無菌條件下加入酒精2%（體積分數），接入醋酸菌斜面種子，在32～34℃下振蕩培養24h。

2.二級種子培養

培養方法與一級種子的培養方法相同，但裝液量改為250mL。接入一級種子的量為10%（體積分數）。在32～34℃下振蕩培養16h。

3.三級種子培養

將8.5°Bé的水解糖液泵入50L種子罐中，裝液量為35L。100℃滅菌10min，待降溫至32℃左右時，接入10%（體積分數）酵母培養液，于30℃下靜置培養30h，當酒精含量達到4%～6%時即可。然后接入醋酸菌二級種子液10%（體積分數），培養條件為通風比1∶0.3，攪拌轉速360r/min，罐壓30kPa，培養溫度32～34℃，時間12～16h。培養終點為培養液的醋酸含量達到2g/100mL，否則可適當延長或縮短培養時間。

4.四級種子培養

8.5°Bé水解糖液泵入500L種子罐，裝液量為350L。培養基的制備與三級種子的相同。接入醋酸菌三級種子液10%（體積分數）。培養時，通風比為1∶0.25，其余條件與三級種子的培養相同。

四級種子用于液體深層發酵法制醋。