第三節 滅菌與無菌技術

滅菌系指采用適當的物理或化學方法殺滅或除去物體上或物品中活的微生物（包括繁殖體和芽孢）的過程。微生物包括細菌、真菌、病毒等，微生物的種類不同，滅菌方法不同，滅菌效果也不同。細菌的芽孢具有較強的抗熱能力，因此滅菌效果常以殺滅芽孢為標準。滅菌是藥劑制備中一項重要的操作，對于注射劑、眼用制劑及應用于創面的制劑等無菌制劑是不可缺少的環節。藥劑學中采用的滅菌措施必須達到既要除去或殺滅微生物，又要保證藥物的穩定性、治療作用及安全性的基本要求；其與微生物學的滅菌不盡相同。因此，選擇滅菌方法必須把滅菌效果與藥物性質結合起來一并考慮。藥劑學中滅菌法可分為三大類：即物理滅菌法、化學滅菌法與無菌操作法。

一、藥物制劑的衛生標準

為了確保藥品安全有效，《中國藥典》2010版一部附錄XIII-C和二部Ⅻ-J微生物限度檢查法項下對各類藥物制劑的微生物限度有明確的規定。

（一）致病菌

口服藥品每克或每毫升不得檢出大腸桿菌，含動物藥及臟器的藥品同時不得檢出沙門菌；外用藥品每克或每毫升不得檢出綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌；陰道、創傷、潰瘍用制劑不得檢出破傷風桿菌。

藥物制劑檢出大腸桿菌或其他致病菌時，均按一次檢出結果為準，不再另行抽樣復檢，該產品則以不合格處理。

（二）活螨

螨的存在不僅可蛀蝕藥品，使其變質失效，也可直接危害人體健康或傳播疾病。因此，用于口服、創傷、黏膜和腔道的藥品，不得檢出活螨。

（三）細菌和霉菌

根據藥物制劑實際工藝處理的情況，不同的劑型和給藥方式有不同的細菌數和霉菌數的限度標準與要求。

1．口服給藥制劑

（1）化學藥物制劑或不含中藥原粉的中藥制劑 ①細菌數：每1g不得過1000個；每1mL不得過100個。②霉菌和酵母菌數：每1g或1mL不得過100個。③大腸埃希菌：每1g或1mL不得檢出。

（2）含有中藥原粉的中藥制劑（如丸劑、全粉片、半浸膏片等） ①細菌數：每1g不得過10000個（丸劑每1g不得過30000個）；每lmL不得過500。②霉菌和酵母菌數：每1g或1mL不得過100個。③大腸菌群：每1g應小于100個；每1mL應小于10個。

（3）中藥制劑中含有豆豉、神曲等發酵成分的制劑 ①細菌數：每1g不得過100000個；每1mL不得過1000個。②霉菌和酵母菌數：每1g不得過500個；每1mL不得過100個。③大腸埃希菌：每1g或1mL不得檢出。④大腸菌群：每1g應小于100個；每1mL應小于10個。

2．局部給藥制劑

（1）用于手術、燒傷或嚴重創傷的局部給藥制劑 應符合無菌檢查法無菌的規定。

（2）中藥制劑中用于表皮或黏膜不完整的含中藥原粉的局部給藥制劑 ①細菌數：每1g，或10cm2 不得過1000個；每1mL不得過100個。②霉菌和酵母菌數：每1g、lmL或10cm2 不得過100個。③金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌：每1g、1mL或10cm2 不得檢出。

（3）中藥制劑中用于表皮或黏膜完整的含中藥原粉的局部給藥制劑 ①細菌數：每1g或10cm2 不得過10000個；每1mL不得過100個。②霉菌和酵母菌數：每1g、1mL或10cm2不得過100個。③金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌：每1g、1mL或10cm2 不得檢出。

（4）耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑 ①細菌數：每1g、1mL或10cm2不得過100個。②霉菌和酵母菌數：每1g、1mL或10cm2不得過10個。③金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌：每lg、1mL或10cm2不得檢出。④大腸埃希菌：鼻及呼吸道給藥的制劑，每1g、1mL或10cm2不得檢出。

（5）陰道、尿道給藥制劑 ①細菌數：每1g或1mL不得過100個。②霉菌和酵母菌數：每1g或1mL應小于10個。③金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、梭菌：每1g或1mL不得檢出。

（6）直腸給藥制劑 ①細菌數：每1g不得過1000個；每1mL不得過100個。②霉菌和酵母菌數：每1g或1mL不得過100個。③金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌：每1g或1mL不得檢出。

（7）其他局部給藥制劑 ①細菌數：每1g、1mL或10cm2 不得過100個。②霉菌和酵母菌數：每1g、1mL或10cm2 不得過100個。③金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌：每1g、1mL或10cm2 不得檢出。

（8）眼部給藥制劑 ①細菌數：每1g或1mL不得過10個。②霉菌和酵母菌數：每1g或1mL不得檢出。③金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌：每1g或1mL不得檢出。

（9）注射劑 應無菌，照《中國藥典》2010版附錄Ⅻ-H無菌檢査法檢查，應符合規定。

3．含動物組織（包括提取物）及動物類原藥材粉（蜂王漿、動物角、阿膠除外）的口服給藥制劑 每10g或10mL不得檢出沙門菌。

4．有兼用途徑的制劑 應符合各給藥途徑的標準。

5．原料及輔料 參照相應制劑的微生物限度標準執行。

任何藥品出現外觀發霉、生蟲或生活螨的現象，均應作不合格處理；液體制劑的瓶蓋周圍如出現發霉或有活螨，也作不合格處理。上述不合格的藥品無需再抽樣復檢。

二、物理滅菌法

利用蛋白質與核酸具有遇熱、射線不穩定的特性，采用加熱、射線和過濾方法，殺滅或除去微生物的技術稱為物理滅菌法，亦稱物理滅菌技術。滅菌是制劑制備中的重要操作，對注射劑、眼用制劑等無菌制劑尤為重要。物理滅菌法分為干熱滅菌法、濕熱滅菌法、射線滅菌法、過濾滅菌法等。

（一）干熱滅菌法

干熱滅菌法系指在干燥環境中進行滅菌的技術，其中包括火焰滅菌法和干熱空氣滅菌法。

1．火焰滅菌法 系指用火焰直接灼燒滅菌的方法。該法滅菌迅速、可靠、簡便，適用于耐火焰材質（如金屬、玻璃及瓷器等）的物品與用具的滅菌，不適合藥品的滅菌。

2．干熱空氣滅菌法 系指用高溫干熱空氣滅菌的方法。該法適用于耐高溫的玻璃和金屬制品以及不允許濕氣穿透的油脂類（如油性軟膏基質、注射用油等）和耐高溫的粉末化學藥品的滅菌，不適于橡膠、塑料及大部分藥品的滅菌。

在干燥狀態下，由于熱穿透力較差，微生物的耐熱性較強，必須長時間受高熱作用才能達到滅菌的目的。因此，干熱空氣滅菌法采用的溫度一般比濕熱滅菌法高。為了確保滅菌效果，一般規定為：135～145℃滅菌3～5h;160～170℃滅菌2～4h;180～200℃滅菌0.5～1h。

（二）濕熱滅菌法

濕熱滅菌法系指用飽和蒸氣、沸水或流通蒸氣進行滅菌的方法。由于蒸氣潛熱大，穿透力強，容易使蛋白質變性或凝固，因此該法的滅菌效率比干熱滅菌法高，是藥物制劑生產過程中最常用的方法。濕熱滅菌法可分類為：熱壓滅菌法、流通蒸氣滅菌法、煮沸滅菌法和低溫間歇滅菌法。

1．熱壓滅菌法 系指用高壓飽和水蒸氣加熱殺滅微生物的方法。該法具有很強的滅菌效果，滅菌可靠，能殺滅所有細菌繁殖體和芽孢，適用于耐高溫和耐高壓蒸氣的所有藥物制劑、玻璃容器、金屬容器、瓷器、橡膠塞、濾膜過濾器等。

在一般情況下，熱壓滅菌法所需的溫度（蒸氣表壓）與時間的關系為：115℃（67kPa）、30min;121℃（97kPa）、20min;126℃（139kPa）、15min。在特殊情況下，可通過實驗確認合適的滅菌溫度和時間。

影響熱壓滅菌的主要因素有：①微生物的種類與數量：微生物的種類不同，耐熱、耐壓性能存在很大差異，不同發育階段對熱、壓的抵抗力不同，其耐熱、耐壓的次序為芽孢＞繁殖體＞衰老體。微生物數量愈少，所需滅菌時間愈短。②蒸氣性質：蒸氣有飽和蒸氣、濕飽和蒸氣和過熱蒸氣。飽和蒸氣熱含量較高，熱穿透力較強，滅菌效率高；濕飽和蒸氣因含有水分，熱含量較低，熱穿透力較差，滅菌效率較低；過熱蒸氣溫度高于飽和蒸氣，但穿透力差，滅菌效率低，且易引起藥品的不穩定性。因此，熱壓滅菌應采用飽和蒸氣。③藥品性質和滅菌時間：一般而言，滅菌溫度愈高，滅菌時間愈長，藥品被破壞的可能性愈大。因此，在設計滅菌溫度和滅菌時間時必須考慮藥品的穩定性，即在達到有效滅菌的前提下，盡可能降低滅菌溫度和縮短滅菌時間。④其他方面：介質pH對微生物的生長和活力具有較大影響。一般情況下，在中性環境微生物的耐熱性最強，堿性環境次之，酸性環境則不利于微生物的生長和發育。介質中的營養成分愈豐富（如含糖類、蛋白質等），微生物的抗熱性愈強，應適當提高滅菌溫度或延長滅菌時間。

熱壓滅菌常用的設備為臥式熱壓滅菌柜，如圖3-6所示。

臥式熱壓滅菌柜是一種常用的大型滅菌設備，該設備全部采用合金制成，具有耐高壓性能，帶有夾套的滅菌柜內備有帶軌道的格車。壓力表和溫度表置于滅菌柜頂部，兩壓力表分別指示夾套內和柜內蒸氣壓力，兩表中間為溫度表。滅菌柜頂部安有排氣閥，以便開始通入加熱蒸氣時排盡不凝性氣體。

滅菌操作：先開夾套中蒸氣加熱10min，當夾套壓力上升至所需壓力時，將待滅菌物品置于金屬編制籃中，排列于格車架上，推入柜室，關閉柜門，并將門閘旋緊。待夾套加熱完成后，將加熱蒸氣通入柜內，當溫度上升至規定溫度（如12l℃）時，計時（此時即為滅菌開始時間），柜內壓力表應固定在規定壓力（如97kPa左右）。滅菌完成后，先關閉蒸氣閥，排氣至壓力表降至“0”點，開啟柜門，滅菌物品冷卻后取出。

為保證滅菌效率，使用熱壓滅菌柜時應注意：①必須使用飽和蒸氣。②必須排盡滅菌柜內空氣：若有空氣存在，壓力表的指示壓力并非純蒸氣壓，而是蒸氣和空氣的總壓，滅菌溫度難以達到規定值。因此，在滅菌柜上往往附有真空裝置，以便在通入蒸氣前將柜內空氣盡可能抽盡。③滅菌時間應以全部藥液溫度達到所要求的溫度時開始計時：由于滅菌柜的表頭溫度是指滅菌柜內溫度，而非滅菌物內部溫度，最好設計直接測定被滅菌物內溫度的裝置或使用溫度指示劑。④滅菌完畢后必須先停止加熱，逐漸減壓至壓力表指針為“0”后，放出柜內蒸氣，使柜內壓力與大氣壓相等，稍稍打開滅菌柜，10～1 5min后全部打開，以免柜內外壓力差和溫度差太大，造成被滅菌物沖出或玻璃瓶炸裂而傷害操作人員，確保安全生產。

2．流通蒸氣滅菌法 系指在常壓下，采用100℃流通蒸氣加熱殺滅微生物的方法。滅菌時間通常為30～60min。該法適用于消毒及不耐高熱制劑的滅菌。但不能保證殺滅所有的芽孢，不是可靠的滅菌法。

3．煮沸滅菌法 系指將待滅菌物置沸水中加熱滅菌的方法。煮沸時間通常為30～60min。該法滅菌效果較差，常用于注射器、注射針等器皿的消毒。必要時可加入適量的抑菌劑，如三氯叔丁醇、甲酚、氯甲酚等，以提高滅菌效果。

4．低溫間歇滅菌法 系指將待滅菌物置60～80℃的水或流通蒸氣中加熱60min，殺滅微生物繁殖體后，在室溫條件下放置24h，讓待滅菌物中的芽孢發育成繁殖體，再加熱滅菌、放置，反復多次，直至殺滅所有芽孢。該法適合于不耐高溫、熱敏感物料和制劑的滅菌。其缺點是費時、工效低、滅菌效果差，加入適量抑菌劑可提高滅菌效率。

（三）過濾滅菌法

過濾滅菌法系指采用過濾法除去微生物的方法，該法屬于機械除菌方法，該除菌裝置稱為除菌過濾器。該法適合于對熱不穩定的藥物溶液、氣體、水等物品的滅菌。

滅菌用過濾器應有較高的過濾效率，能有效地除盡物料中的微生物，濾材與濾液中的成分不發生相互交換，濾器易清洗，操作方便等。為了有效地除盡微生物，濾器孔徑必須小于芽孢體積（＞0.5μm）。常用的除菌過濾器有：0.22μm或0.3μm的微孔濾膜濾器和G6（號）垂熔玻璃濾器。過濾滅菌應在無菌條件下進行操作，為了保證產品的無菌，必須對過濾過程進行無菌檢測。

（四）射線滅菌法

射線滅菌法系指采用輻射、微波和紫外線殺滅微生物和芽孢的方法。

1．輻射滅菌法 系指采用放射性同位素（60 Co和137Cs）放射的γ射線殺滅微生物和芽孢的方法，輻射滅菌劑量一般為2.5×104Gy（戈瑞）。本法適合于熱敏物料和制劑的滅菌，常用于維生素、抗生素、激素、生物制品、中藥材和中藥制劑、醫療器械、藥用包裝材料及藥用高分子材料等物質的滅菌。

2．微波滅菌法 采用微波（頻率為300MHz～300kMHz）照射產生的熱能殺滅微生物和芽孢的方法。該法適合液體和固體物料的滅菌，且對固體物料具有干燥作用。其特點是：微波能穿透到介質和物料的深部，可使介質和物料表里一致地加熱；且具有低溫、常壓、高效、快速（一般為2～3min）、低能耗、無污染、易操作、易維護、產品保質期長（可延長1/3以上）等特點。

3．紫外線滅菌法 系指用紫外線（能量）照射殺滅微生物和芽孢的方法。用于紫外滅菌的波長一般為200～300nm，滅菌力最強的波長為254nm。該方法屬于表面滅菌。

紫外線不僅能使核酸蛋白變性，而且能使空氣中氧氣產生微量臭氧，而達到共同殺菌作用。該法適合于照射物表面滅菌、無菌室空氣及蒸餾水的滅菌；不適合于藥液的滅菌及固體物料深部的滅菌。由于紫外線是以直線傳播，可被不同的表面反射或吸收，穿透力微弱，普通玻璃即可吸收紫外線，因此裝于容器中的藥物不能用紫外線滅菌。紫外線對人體有害，照射過久易發生結膜炎、紅斑及皮膚燒灼等傷害，故一般在操作前開啟1～2h，操作時關閉；必須在操作過程中照射時，對操作者的皮膚和眼睛應采用適當的防護措施。

三、化學滅菌法

化學滅菌法系指用化學藥品直接作用于微生物而將其殺滅的方法。對微生物具有觸殺作用的化學藥品稱殺菌劑，可分為氣體殺菌劑和液體殺菌劑。殺菌劑僅對微生物繁殖體有效，不能殺滅芽孢?；瘜W滅菌的目的在于減少微生物的數目，以控制一定的無菌狀態?；瘜W殺菌劑的殺滅效果主要取決于微生物的種類與數量、物體表面光潔度或多孔性、以及殺菌劑的性質等。

（一）氣體滅菌法

氣體滅菌法系指采用氣態殺菌劑（如環氧乙烷、甲醛、丙二醇、甘油和過氧乙酸蒸氣等）進行滅菌的方法。該法特別適合環境消毒以及不耐加熱滅菌的醫用器具、設備和設施等的消毒，亦用于粉末注射劑，不適合對產品質量有損害的場合。同時應注意殘留的殺菌劑和與藥物可能發生的相互作用。

（二）藥液滅菌法

藥液滅菌法系指采用殺菌劑溶液進行滅菌的方法。該法常應用于其他滅菌法的輔助措施，適合于皮膚、無菌器具和設備的消毒。常用消毒液有：75%乙醇、1%聚維酮碘溶液、0.1%～0.2%苯扎溴銨（新潔爾滅）溶液、酚或煤酚皂溶液等。

四、無菌操作法

無菌操作法系指整個過程控制在無菌條件下進行的一種操作方法。該法適合一些不耐熱藥物的注射劑、眼用制劑、皮試液、海綿劑和創傷制劑的制備。按無菌操作法制備的產品，一般不再滅菌，但某些特殊（耐熱）品種亦可進行再滅菌（如青霉素G等）。最終采用滅菌的產品，其生產過程一般采用避菌操作（盡量避免微生物污染），如大部分注射劑的制備等。

（一）無菌操作室的滅菌

無菌操作室的滅菌常采用紫外線、液體和氣體滅菌法對無菌操作室環境進行滅菌。

1．紫外線滅菌 是無菌室滅菌的常規方法，該方法應用于間歇和連續操作過程中。一般在每天工作前開啟紫外燈1h左右，操作間歇中亦應開啟0.5～1h，必要時可在操作過程中開啟（應注意操作人員眼、皮膚等的保護）。

2．液體滅菌 是無菌室較常用的輔助滅菌方法，主要采用3%苯酚溶液、2%煤酚皂溶液、0.2%苯扎溴銨或75%乙醇噴灑或擦拭，用于無菌室的空間、墻壁、地面、用具等方面的滅菌。

3．甲醛溶液加熱熏蒸法 該方法的滅菌較徹底，是常用的方法之一。氣體發生裝置（圖3-7）是采用蒸氣加熱夾層鍋，使液態甲醛汽化成甲醛蒸氣，經蒸氣出口送入總進風道，由鼓風機吹入無菌室，連續3h后，關閉密熏12～24h，并應保持室內濕度＞60%，溫度＞25℃，以免低溫導致甲醛蒸氣聚合而附著于冷表面，從而降低空氣中甲醛濃度，影響滅菌效率。密熏完畢后，將25%的氨水經加熱，按一定流量送入無菌室內，以清除甲醛蒸氣，然后開啟排風設備，并通入無菌空氣直至室內排盡甲醛。

（二）無菌操作

無菌操作室、層流潔凈工作臺和無菌操作柜是無菌操作的主要場所，無菌操作所用的一切物品、器具及環境，均需按前述滅菌法滅菌，如安瓿應150～180℃、2～3h干熱滅菌，橡皮塞應121℃、1h熱壓滅菌等。操作人員進入無菌操作室前應洗澡，并更換已滅菌的工作服和清潔的鞋子，不得外露頭發和內衣，以免污染。

小量無菌制劑的制備，普遍采用層流潔凈工作臺（圖3-8）進行無菌操作，該設備具有良好的無菌環境，使用方便，效果可靠。無菌操作柜目前常用于試制階段。

五、滅菌參數及其影響因素

近年來對滅菌過程和無菌檢查中存在的問題已引起人們的關注。在檢品中存在微量的微生物時，往往難以用現行的無菌檢驗法檢出。因此，有必要對滅菌方法的可靠性進行驗證。F與F0值可作為驗證滅菌可靠性的參數。

（一）D值與Z值

1．D值 研究表明，微生物受高溫、輻射、化學藥品等作用時就要被殺滅，其殺滅速度符合一級過程，即：

或

式中：N0——原有微生物數；

Nt——滅菌時間為t時殘存的微生物數；

k——殺滅速度常數。

lgNt對t作圖得一直線，斜率：，設斜率的負倒數為D值，即：

由式（3-5）可知，當時lgN0-lgNt=lg100-lg10=1, D=t，即D的物理意義為，在一定溫度下殺滅微生物90%或殘存率為10%時所需的滅菌時間（min）。

2．Z值 滅菌條件不同，其滅菌速率也不同。當溫度升高時，速度常數k增大，因而D值（滅菌時間）隨溫度的升高而減少。在一定溫度范圍內（100～138℃）lgD與溫度T之間呈直線關系。設：

故Z值為降低一個lgD值所需升高的溫度數。即：滅菌時間減少到原來的1/10所需升高的溫度。如Z=10℃，意思是：滅菌時間減少到原來滅菌時間的1/10，而滅菌效果不變所需升高的滅菌溫度為10℃。式（3-5）可以改寫為：

設Z=1 0℃, T1=110℃, T2=121℃，則D2=0.079D1。即110℃滅菌1min與121℃滅菌0.079min效果相當。

若Z=10℃，滅菌溫度每增加一度，則D1=1.25 9D2，即溫度每增加一度，其滅菌速率提高25.9%。

（二）F值與F0值

1．F值 F值為在一定滅菌溫度（T）下給定的Z值所產生的滅菌效果與在參比溫度（T0）下給定Z值所產生的滅菌效果相同時所相當的滅菌時間，以min為單位。F值常用于干熱滅菌，其數學表達式如下：

式中：Δt——測量被滅菌物溫度的時間間隔，一般為0.5～1min；

T——每個時間間隔Δt所測得被滅菌物的溫度；

T0——參比溫度。

2．F0值 F0值為一定滅菌溫度（T）下，Z值為10℃時所產生的滅菌效果與121℃、Z值為10℃時所產生的滅菌效果相同時所相當的時間（min）。F0值目前僅限于熱壓滅菌。物理F0的數學表達式為：

根據式（3-9），在滅菌過程中，僅需記錄被滅菌物的溫度與時間，即可計算F0值。由于F0 值是將不同滅菌溫度計算到相當于121℃熱壓滅菌時的滅菌效力，故F0 值可作為滅菌過程的比較參數，對滅菌過程的設計及驗證滅菌效果極為有用。鑒于F0值體現了滅菌溫度與時間對滅菌效果的統一，該數值更為精確、實用。

生物F0值的數學表達式為：

即生物F0值可看做D121℃與微生物數目的對數降低值的乘積。式中Nt為滅菌后預計達到的微生物殘存數，即染菌度概率（probability of nonsterility），當Nt達到10-6時（原有菌數的百萬分之一），可認為滅菌效果較可靠。因此，生物F0值可認為是以相當于121℃熱壓滅菌時，殺滅容器中全部微生物所需要的時間。

影響F0值的因素主要有：①滅菌產品溶液性質、充填量等；②容器大小、形狀及熱穿透性等；③容器在滅菌器內的數量及分布等，該項因素在生產過程中影響最大，故必須注意滅菌器內各層、四角、中間位置熱分布是否均勻，并根據實際測定數據，進行合理排布。

測定F0值時應注意的問題：①選擇靈敏度高，重現性好，使用精密度為0.1℃的熱電偶，并對其進行校正；②滅菌時應將熱電偶的探針置于被測樣品的內部，經滅菌器通向滅菌柜外的溫度記錄儀（一般附有F0顯示器）; ③對滅菌工藝和滅菌器進行驗證，滅菌器內熱分布應均勻，重現性好。

為了確保滅菌效果，應嚴格控制原輔料質量和環境條件，盡量減少微生物的污染，采取各種有效措施使每一容器的含菌數控制在一定水平以下（一般含菌數為10以下，即lgNt＜1）；計算、設置 F0值時，應適當考慮增加安全系數，一般增加理論值的50%，即規定 F0值為8min，實際操作應控制在12min。