分枝桿菌分離培養包括固體培養和液體培養方法，用于分離檢測分支桿菌。固體培養是我國基層目前使用最多的方法，下述將主要針對簡單法固體培養進行描述（圖3-8），液體分離培養方法須嚴格按照廠家說明進行（圖3-9）。分枝桿菌分離培養應選擇2份痰標本進行分離培養。

（1）對照標記的患者姓名，在生物安全柜內將約1～2ml標本轉移至相應前處理管中，旋緊痰標本容器螺旋蓋。

（2）視標本性狀，將1～2倍的4%NaOH溶液加入前處理管中，旋緊處理管螺旋蓋，立即開始計時15分鐘。

（3）在生物安全柜內，將處理管在渦旋振蕩器上渦旋振蕩30秒直至痰標本充分液化。

（4）將前處理管置于試管架內，置于生物安全柜內，室溫靜置，直至15分鐘計時結束。

（5）擰開羅氏培養管螺旋蓋，檢查培養基斜面底部的凝固水，如果凝固水過多，則沿著斜面相對的一面的培養管內壁，將凝固水棄去。

（6）用無菌吸管吸取前處理后的痰標本，保持培養基斜面水平，均勻接種至酸性羅氏培養基斜面上，每支培養基接種0.1～0.15ml（約2～3滴），接種時第一滴液體接種至斜面中部，第二滴接種到培養基上部（距離培養基頂端1cm處），旋緊培養管螺旋蓋，輕輕轉動并放低培養管底部，使接種的液體均勻地在斜面上鋪開。

（1）將培養基放置在斜面放置架上，保持培養基斜面水平向上。

（2）連同斜面放置架將培養管置于恒溫培養箱內，（36±1）℃孵育。

（3）待24小時后，直立放置培養管，（36±1）℃條件下繼續孵育。

接種后第3日和第7日觀察培養情況，此后每周觀察一次，直至第8周末。每次觀察后要在培養結果記錄本上記錄觀察結果。

（1）拿出MGIT 7ml生長指示管、生長添加劑、PANTA，檢查MGIT生長指示管有無破損及污染（管中液體出現渾濁）。

（2）將MGIT PANTA與15ml MGIT生長添加劑重新混合。

注意：該混合物在2～8℃可穩定保存7天。在保存前貼上標簽，包括內容物、配制時間、有效期及配制人信息。若7天內不能用完，可當時分裝，置于-20℃以下的溫度，保存6個月。

（3）在生長指示管上標記標本編號。

（4）用移液槍在每個MGIT管內添加溶解后的0.8ml PANTA/生長添加劑混合物，注意操作不要污染管，蓋緊MGIT管。

（1）對照標記的患者姓名，在生物安全柜內將約1～2ml標本轉移至相應前處理管中，旋緊痰標本容器螺旋蓋。

（2）視標本性狀，將1～2倍的NALC-NaOH混合溶液加入前處理管中，旋緊處理管螺旋蓋，渦旋震蕩10～20秒，立即開始計時15分鐘。

（3）室溫靜置15分鐘。

（4）加入0.067M的pH為6.8的磷酸鹽緩沖液至45毫升。

（5）離心力3 000×g，離心機溫度為8～10℃，離心15～20分鐘。

（6）在離心期間，按所接種的液體培養基要求，向液體培養基中加入指定量的營養添加劑（如OADC）和抗污染劑（如PANTA）。

（7）離心結束后，將離心筒（杯）取出，在生物安全柜中小心打開離心桶（杯）蓋，取出離心管。

（8）小心棄掉離心管內上清液至含消毒劑的廢液缸中。

（9）加入1ml磷酸鹽緩沖液至離心管中，重懸沉淀。

（10）吸取0.5ml重懸液，接種于液體培養基內。

按照液體培養基的具體要求放置到培養儀器相應的位置進行孵育。

（1）如果培養儀器報告陽性，應按照液體培養基的具體要求對培養液進行涂片染色顯微鏡檢查。

（2）如果涂片檢查為抗酸菌陽性，則報告培養陽性，進行進一步鑒定和藥物敏感性試驗。

（3）如果難以確定，可用培養液接種血瓊脂培養板或巧克力瓊脂培養板，如果在24小時內有菌落生長，則判定不是結核分枝桿菌生長。如果涂片檢查發現有非抗酸菌存在，則報告污染。如果任何微生物皆未發現，應繼續培養。

（4）6周培養儀器未報告陽性，則判定為培養陰性。

觀察培養基外觀，酸性羅氏培養基綠色略偏藍，中性羅氏培養基為綠色。如果培養基異常，顏色灰暗，過藍或過黃，均不能使用。另外培養基質地過軟或干涸、勻化性差等均不能使用。每批新制作或新批號的商品化培養基至少要抽取5%進行無菌性測試，有條件時進行敏感性測試。

抗結核治療會降低分離培養陽性率，用于分離培養的痰標本盡可能在治療前采集。

若不能在痰標本采集后立即進行分離培養操作，應將痰標本儲存于2～8℃冰箱暫時保存，防止痰液干涸或污染。從收集痰標本至處理痰標本的時間至多不能超過7天。

確保痰標本處理液濃度為4%，處理時間為自加入前處理液開始至結束15分鐘內，處理時間過短會造成過高的污染率，如果標本量過大，應分批次處理（如每次處理6～8個痰標本），避免因每批處理標本過多，導致處理時間過長而降低培養的陽性率。

如果經過正常的前處理過程后，仍有部分肉眼可見的沉渣或痰栓，接種前不要吹打或混勻，直接吸取上層液體接種，減少污染的發生。

接種處理液時盡量鋪滿整個培養基斜面。

接種菌液的培養基應水平放置放置24小時，待菌液完全吸收后再直立放置繼續孵育。

結核分枝桿菌的最適宜生長溫度為37℃左右，溫度過高或過低均會造成結核分枝桿菌停止生長，因此要每日監測培養箱的溫度，確保溫度波動范圍為35～37℃之間。

每月定期匯總分析反映分枝桿菌分離培養工作的質量指標，連續監測各指標，指標值出現明顯變化應立即查詢原因，并盡快解決。

分枝桿菌分離培養質量指標包括初診患者培養陽性比例、初診患者結核分枝桿菌培養陽性比例、涂陽標本培養陽性比例、培養發生污染比例（固體）、培養發生污染比例（液體）、分離培養周轉時間（固體）、分離培養周轉時間（液體）。

初診患者培養陽性比例=初診患者中培養陽性的患者數量/初診患者中開展培養的總數量

初診患者結核分枝桿菌培養陽性的比例=初診患者中分離培養陽性且菌株經鑒定為結核分枝桿菌的患者數量/初診患者中開展培養的總數量

涂陽標本培養陽性比例=痰涂片鏡檢陽性且培養陽性的標本數量/痰涂片鏡檢陽性且開展分離培養的標本數量

培養發生污染比例=分離培養發生污染的培養管（基）數量/開展分離培養的總培養管（基）數量

分離培養周轉時間=自實驗室接收到標本至實驗室報告分離培養結果報告的時間間隔