分枝桿菌分離培養(yǎng)包括固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)方法，用于分離檢測(cè)分支桿菌。固體培養(yǎng)是我國(guó)基層目前使用最多的方法，下述將主要針對(duì)簡(jiǎn)單法固體培養(yǎng)進(jìn)行描述（圖3-8），液體分離培養(yǎng)方法須嚴(yán)格按照廠家說(shuō)明進(jìn)行（圖3-9）。分枝桿菌分離培養(yǎng)應(yīng)選擇2份痰標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)。

（1）對(duì)照標(biāo)記的患者姓名，在生物安全柜內(nèi)將約1～2ml標(biāo)本轉(zhuǎn)移至相應(yīng)前處理管中，旋緊痰標(biāo)本容器螺旋蓋。

（2）視標(biāo)本性狀，將1～2倍的4%NaOH溶液加入前處理管中，旋緊處理管螺旋蓋，立即開(kāi)始計(jì)時(shí)15分鐘。

（3）在生物安全柜內(nèi)，將處理管在渦旋振蕩器上渦旋振蕩30秒直至痰標(biāo)本充分液化。

（4）將前處理管置于試管架內(nèi)，置于生物安全柜內(nèi)，室溫靜置，直至15分鐘計(jì)時(shí)結(jié)束。

（5）擰開(kāi)羅氏培養(yǎng)管螺旋蓋，檢查培養(yǎng)基斜面底部的凝固水，如果凝固水過(guò)多，則沿著斜面相對(duì)的一面的培養(yǎng)管內(nèi)壁，將凝固水棄去。

（6）用無(wú)菌吸管吸取前處理后的痰標(biāo)本，保持培養(yǎng)基斜面水平，均勻接種至酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上，每支培養(yǎng)基接種0.1～0.15ml（約2～3滴），接種時(shí)第一滴液體接種至斜面中部，第二滴接種到培養(yǎng)基上部（距離培養(yǎng)基頂端1cm處），旋緊培養(yǎng)管螺旋蓋，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)并放低培養(yǎng)管底部，使接種的液體均勻地在斜面上鋪開(kāi)。

（1）將培養(yǎng)基放置在斜面放置架上，保持培養(yǎng)基斜面水平向上。

（2）連同斜面放置架將培養(yǎng)管置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，（36±1）℃孵育。

（3）待24小時(shí)后，直立放置培養(yǎng)管，（36±1）℃條件下繼續(xù)孵育。

接種后第3日和第7日觀察培養(yǎng)情況，此后每周觀察一次，直至第8周末。每次觀察后要在培養(yǎng)結(jié)果記錄本上記錄觀察結(jié)果。

（1）拿出MGIT 7ml生長(zhǎng)指示管、生長(zhǎng)添加劑、PANTA，檢查MGIT生長(zhǎng)指示管有無(wú)破損及污染（管中液體出現(xiàn)渾濁）。

（2）將MGIT PANTA與15ml MGIT生長(zhǎng)添加劑重新混合。

注意：該混合物在2～8℃可穩(wěn)定保存7天。在保存前貼上標(biāo)簽，包括內(nèi)容物、配制時(shí)間、有效期及配制人信息。若7天內(nèi)不能用完，可當(dāng)時(shí)分裝，置于-20℃以下的溫度，保存6個(gè)月。

（3）在生長(zhǎng)指示管上標(biāo)記標(biāo)本編號(hào)。

（4）用移液槍在每個(gè)MGIT管內(nèi)添加溶解后的0.8ml PANTA/生長(zhǎng)添加劑混合物，注意操作不要污染管，蓋緊MGIT管。

（1）對(duì)照標(biāo)記的患者姓名，在生物安全柜內(nèi)將約1～2ml標(biāo)本轉(zhuǎn)移至相應(yīng)前處理管中，旋緊痰標(biāo)本容器螺旋蓋。

（2）視標(biāo)本性狀，將1～2倍的NALC-NaOH混合溶液加入前處理管中，旋緊處理管螺旋蓋，渦旋震蕩10～20秒，立即開(kāi)始計(jì)時(shí)15分鐘。

（3）室溫靜置15分鐘。

（4）加入0.067M的pH為6.8的磷酸鹽緩沖液至45毫升。

（5）離心力3 000×g，離心機(jī)溫度為8～10℃，離心15～20分鐘。

（6）在離心期間，按所接種的液體培養(yǎng)基要求，向液體培養(yǎng)基中加入指定量的營(yíng)養(yǎng)添加劑（如OADC）和抗污染劑（如PANTA）。

（7）離心結(jié)束后，將離心筒（杯）取出，在生物安全柜中小心打開(kāi)離心桶（杯）蓋，取出離心管。

（8）小心棄掉離心管內(nèi)上清液至含消毒劑的廢液缸中。

（9）加入1ml磷酸鹽緩沖液至離心管中，重懸沉淀。

（10）吸取0.5ml重懸液，接種于液體培養(yǎng)基內(nèi)。

按照液體培養(yǎng)基的具體要求放置到培養(yǎng)儀器相應(yīng)的位置進(jìn)行孵育。

（1）如果培養(yǎng)儀器報(bào)告陽(yáng)性，應(yīng)按照液體培養(yǎng)基的具體要求對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行涂片染色顯微鏡檢查。

（2）如果涂片檢查為抗酸菌陽(yáng)性，則報(bào)告培養(yǎng)陽(yáng)性，進(jìn)行進(jìn)一步鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)。

（3）如果難以確定，可用培養(yǎng)液接種血瓊脂培養(yǎng)板或巧克力瓊脂培養(yǎng)板，如果在24小時(shí)內(nèi)有菌落生長(zhǎng)，則判定不是結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)。如果涂片檢查發(fā)現(xiàn)有非抗酸菌存在，則報(bào)告污染。如果任何微生物皆未發(fā)現(xiàn)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)。

（4）6周培養(yǎng)儀器未報(bào)告陽(yáng)性，則判定為培養(yǎng)陰性。

觀察培養(yǎng)基外觀，酸性羅氏培養(yǎng)基綠色略偏藍(lán)，中性羅氏培養(yǎng)基為綠色。如果培養(yǎng)基異常，顏色灰暗，過(guò)藍(lán)或過(guò)黃，均不能使用。另外培養(yǎng)基質(zhì)地過(guò)軟或干涸、勻化性差等均不能使用。每批新制作或新批號(hào)的商品化培養(yǎng)基至少要抽取5%進(jìn)行無(wú)菌性測(cè)試，有條件時(shí)進(jìn)行敏感性測(cè)試。

抗結(jié)核治療會(huì)降低分離培養(yǎng)陽(yáng)性率，用于分離培養(yǎng)的痰標(biāo)本盡可能在治療前采集。

若不能在痰標(biāo)本采集后立即進(jìn)行分離培養(yǎng)操作，應(yīng)將痰標(biāo)本儲(chǔ)存于2～8℃冰箱暫時(shí)保存，防止痰液干涸或污染。從收集痰標(biāo)本至處理痰標(biāo)本的時(shí)間至多不能超過(guò)7天。

確保痰標(biāo)本處理液濃度為4%，處理時(shí)間為自加入前處理液開(kāi)始至結(jié)束15分鐘內(nèi)，處理時(shí)間過(guò)短會(huì)造成過(guò)高的污染率，如果標(biāo)本量過(guò)大，應(yīng)分批次處理（如每次處理6～8個(gè)痰標(biāo)本），避免因每批處理標(biāo)本過(guò)多，導(dǎo)致處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而降低培養(yǎng)的陽(yáng)性率。

如果經(jīng)過(guò)正常的前處理過(guò)程后，仍有部分肉眼可見(jiàn)的沉渣或痰栓，接種前不要吹打或混勻，直接吸取上層液體接種，減少污染的發(fā)生。

接種處理液時(shí)盡量鋪滿整個(gè)培養(yǎng)基斜面。

接種菌液的培養(yǎng)基應(yīng)水平放置放置24小時(shí)，待菌液完全吸收后再直立放置繼續(xù)孵育。

結(jié)核分枝桿菌的最適宜生長(zhǎng)溫度為37℃左右，溫度過(guò)高或過(guò)低均會(huì)造成結(jié)核分枝桿菌停止生長(zhǎng)，因此要每日監(jiān)測(cè)培養(yǎng)箱的溫度，確保溫度波動(dòng)范圍為35～37℃之間。

每月定期匯總分析反映分枝桿菌分離培養(yǎng)工作的質(zhì)量指標(biāo)，連續(xù)監(jiān)測(cè)各指標(biāo)，指標(biāo)值出現(xiàn)明顯變化應(yīng)立即查詢?cè)颍⒈M快解決。

分枝桿菌分離培養(yǎng)質(zhì)量指標(biāo)包括初診患者培養(yǎng)陽(yáng)性比例、初診患者結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性比例、涂陽(yáng)標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性比例、培養(yǎng)發(fā)生污染比例（固體）、培養(yǎng)發(fā)生污染比例（液體）、分離培養(yǎng)周轉(zhuǎn)時(shí)間（固體）、分離培養(yǎng)周轉(zhuǎn)時(shí)間（液體）。

初診患者培養(yǎng)陽(yáng)性比例=初診患者中培養(yǎng)陽(yáng)性的患者數(shù)量/初診患者中開(kāi)展培養(yǎng)的總數(shù)量

初診患者結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性的比例=初診患者中分離培養(yǎng)陽(yáng)性且菌株經(jīng)鑒定為結(jié)核分枝桿菌的患者數(shù)量/初診患者中開(kāi)展培養(yǎng)的總數(shù)量

涂陽(yáng)標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性比例=痰涂片鏡檢陽(yáng)性且培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本數(shù)量/痰涂片鏡檢陽(yáng)性且開(kāi)展分離培養(yǎng)的標(biāo)本數(shù)量

培養(yǎng)發(fā)生污染比例=分離培養(yǎng)發(fā)生污染的培養(yǎng)管（基）數(shù)量/開(kāi)展分離培養(yǎng)的總培養(yǎng)管（基）數(shù)量

分離培養(yǎng)周轉(zhuǎn)時(shí)間=自實(shí)驗(yàn)室接收到標(biāo)本至實(shí)驗(yàn)室報(bào)告分離培養(yǎng)結(jié)果報(bào)告的時(shí)間間隔