痰涂片鏡檢包括萋-尼氏染色鏡檢方法和熒光染色方法，用于檢測痰標本中存在的抗酸桿菌。初診患者應收集三份痰標本進行痰涂片鏡檢。

1）一張載玻片上只能涂抹一份痰標本。

2）使用一端有磨砂面的無劃痕新玻片，經95%乙醇擦拭（或浸泡）脫脂或使用脫脂的載玻片，在玻片一端的1/3處用2B鉛筆注明實驗室序號及標本序號。

1）在生物安全柜內小心打開承載痰標本的容器，防止產生氣溶膠或使標本外溢。

2）仔細觀察標本，使用折斷的竹簽茬端，挑取痰標本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05～0.1ml，于玻片正面右側2/3處，均勻涂抹成10mm×20mm卵圓形痰膜。痰膜朝上靜置，自然干燥后（一般約需要30分鐘）進行染色鏡檢。

3）涂抹完畢后的痰標本，在結果報告前應暫時保留。

4）為保證檢驗人員的安全，嚴禁在涂抹痰標本的同時，對載玻片進行加熱。

（1）涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持10mm以上，火焰固定（在5秒內將玻片置于火焰上烤4次）。

（2）滴加石炭酸復紅染液蓋滿玻片，火焰加熱至出現蒸汽后脫離火焰，保持染色5分鐘。染色期間應始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時可續加染色液。加溫時勿使染色液沸騰。

（3）流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染色液，瀝去標本上剩余的水。

（4）自痰膜上端外緣滴加脫色劑布滿痰膜，脫色1分鐘。如有必要，須流水洗去脫色液后，再次脫色至痰膜無可視紅色為止。

（5）流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩余的水。

（6）滴加亞甲藍復染液，染色30秒。

（7）流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復染液，然后瀝去標本上剩余的水，待玻片干燥后鏡檢。

（8）染色合格的玻片，由于被亞甲藍染色而呈亮藍色。將染色后的玻片放置在報紙上，若透過痰膜不能分辨報紙上的文字，則表明該玻片涂抹過厚。

（1）涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持10mm以上。火焰固定（在5秒內將玻片置于火焰上烤4次）。

（2）滴加金胺O熒光染色劑蓋滿玻片，染色10～15分鐘。流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水。

（3）痰膜上端外緣滴加脫色劑，蓋滿玻片，脫色3分鐘或至無色，流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑。

（4）加復染劑復染1分鐘，瀝去復染液，流水自玻片一端輕洗，自然干燥后鏡檢。

使用10×目鏡的雙目顯微鏡讀片。取染色完畢且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片臺上并以卡尺固定。首先使用40×物鏡，轉動卡尺移動玻片至痰膜左端，將光線調節至適當亮度，調節焦距至可見細胞形態；移開40×物鏡，在玻片上滴1～2滴鏡油，使用100×油鏡進行細致觀察。

玻片放置在玻片臺上并以卡尺固定后，首先以10×目鏡、20×物鏡進行鏡檢，發現疑為抗酸桿菌的熒光桿狀物質，使用40×物鏡確認。在暗背景下，抗酸桿菌發出黃色熒光，呈桿狀略彎曲。

對于自己配制或商品化的染色試劑均要監測染色液的質量，每次制備或購買一批新的染色液之后，須使用未經染色的已知陽性和陰性涂片進行染色、鏡檢，并記錄結果。并在效期內使用，嚴禁使用過期的染色試劑。

選取痰標本中膿性、干酪性部分制備痰膜（圖3-2）。

制備適宜厚度的痰膜，將已涂抹痰膜并干燥的玻片放置在報紙上，若透過痰膜不能分辨報紙上的5號字則表明該玻片涂抹過厚，若透過痰膜能夠非常清晰地辨別報紙上的字則表明痰膜涂抹過薄（圖3-3）。

萋-尼氏染色要進行熱染，相比冷染可以提高陽性檢出率。

要保證足夠的染色時間，萋-尼氏染色方法初染液加熱出現蒸汽后保持5分鐘，熒光染色方法初染液染色至少15分鐘。

每批染色時要加入1張陽性和1張陰性涂片作為質控片對染色過程及染色劑進行質量控制。

萋-尼氏染色鏡檢的涂片肉眼觀察染色后的痰膜應呈均勻亮藍色，無紅色斑塊（見圖3-4）。熒光染色涂片呈黃色。

確保顯微鏡的功能正常。

按照結果報告標準仔細觀察足夠的視野數，萋-尼氏染色方法鏡檢時，首先應從左向右觀察相鄰的視野。當玻片移動至痰膜一端時，縱向向下轉換一個視野，然后從右向左觀察，依此類推。

通常20mm的痰膜，使用100×油鏡，每行可觀察約100個視野。仔細觀察完300個視野，一般需要5分鐘以上。報告1+時至少觀察300個視野，報告2+時至少觀察100個視野，報告3+、4+時至少觀察50個視野。熒光染色方法鏡檢報告陰性、實際條數、1+、2+至少觀察50個視野，3+及以上的陽性結果至少觀察20個視野。

鏡下尋找含有大量炎性細胞存在的區域，若僅觀察到含有上皮細胞的區域往往不能檢出抗酸菌（圖3-5）。

每月定期匯總分析反映痰涂片鏡檢工作的質量指標，連續監測各指標，指標值出現明顯變化應立即查詢原因，并盡快解決（圖3-6、圖3-7）。

痰涂片鏡檢質量指標包括初診患者痰涂片鏡檢陽性率、初診患者涂片中低陽性級別（實際條數/300視野、1+）結果比例、隨訪患者痰涂片鏡檢陽性率、痰涂片鏡檢周轉時間等。

初診患者痰涂片鏡檢陽性率=初診患者痰涂片鏡檢陽性片數量/初診患者痰涂片鏡檢片總數量

初診患者涂片中低陽性級別結果比例=初診患者低陽性級別（實際條數/300視野、1+）結果的痰涂片數量/初診患者陽性痰涂片總數量

隨訪患者痰涂片鏡檢陽性率=隨訪患者痰涂片鏡檢陽性片數量/隨訪患者痰涂片鏡檢片總數量

痰涂片鏡檢周轉時間=自實驗室收到痰標本后至實驗室報告痰涂片鏡檢結果的時間間隔