痰涂片鏡檢包括萋-尼氏染色鏡檢方法和熒光染色方法，用于檢測痰標(biāo)本中存在的抗酸桿菌。初診患者應(yīng)收集三份痰標(biāo)本進(jìn)行痰涂片鏡檢。

1）一張載玻片上只能涂抹一份痰標(biāo)本。

2）使用一端有磨砂面的無劃痕新玻片，經(jīng)95%乙醇擦拭（或浸泡）脫脂或使用脫脂的載玻片，在玻片一端的1/3處用2B鉛筆注明實(shí)驗(yàn)室序號(hào)及標(biāo)本序號(hào)。

1）在生物安全柜內(nèi)小心打開承載痰標(biāo)本的容器，防止產(chǎn)生氣溶膠或使標(biāo)本外溢。

2）仔細(xì)觀察標(biāo)本，使用折斷的竹簽茬端，挑取痰標(biāo)本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05～0.1ml，于玻片正面右側(cè)2/3處，均勻涂抹成10mm×20mm卵圓形痰膜。痰膜朝上靜置，自然干燥后（一般約需要30分鐘）進(jìn)行染色鏡檢。

3）涂抹完畢后的痰標(biāo)本，在結(jié)果報(bào)告前應(yīng)暫時(shí)保留。

4）為保證檢驗(yàn)人員的安全，嚴(yán)禁在涂抹痰標(biāo)本的同時(shí)，對(duì)載玻片進(jìn)行加熱。

（1）涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持10mm以上，火焰固定（在5秒內(nèi)將玻片置于火焰上烤4次）。

（2）滴加石炭酸復(fù)紅染液蓋滿玻片，火焰加熱至出現(xiàn)蒸汽后脫離火焰，保持染色5分鐘。染色期間應(yīng)始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時(shí)可續(xù)加染色液。加溫時(shí)勿使染色液沸騰。

（3）流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去染色液，瀝去標(biāo)本上剩余的水。

（4）自痰膜上端外緣滴加脫色劑布滿痰膜，脫色1分鐘。如有必要，須流水洗去脫色液后，再次脫色至痰膜無可視紅色為止。

（5）流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去脫色液，瀝去玻片上剩余的水。

（6）滴加亞甲藍(lán)復(fù)染液，染色30秒。

（7）流水自玻片一端輕緩沖洗，沖去復(fù)染液，然后瀝去標(biāo)本上剩余的水，待玻片干燥后鏡檢。

（8）染色合格的玻片，由于被亞甲藍(lán)染色而呈亮藍(lán)色。將染色后的玻片放置在報(bào)紙上，若透過痰膜不能分辨報(bào)紙上的文字，則表明該玻片涂抹過厚。

（1）涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片間距保持10mm以上。火焰固定（在5秒內(nèi)將玻片置于火焰上烤4次）。

（2）滴加金胺O熒光染色劑蓋滿玻片，染色10～15分鐘。流水自玻片一端輕緩沖洗，洗去染色液，瀝去玻片上剩余的水。

（3）痰膜上端外緣滴加脫色劑，蓋滿玻片，脫色3分鐘或至無色，流水自玻片一端輕洗，洗去脫色劑。

（4）加復(fù)染劑復(fù)染1分鐘，瀝去復(fù)染液，流水自玻片一端輕洗，自然干燥后鏡檢。

使用10×目鏡的雙目顯微鏡讀片。取染色完畢且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片臺(tái)上并以卡尺固定。首先使用40×物鏡，轉(zhuǎn)動(dòng)卡尺移動(dòng)玻片至痰膜左端，將光線調(diào)節(jié)至適當(dāng)亮度，調(diào)節(jié)焦距至可見細(xì)胞形態(tài)；移開40×物鏡，在玻片上滴1～2滴鏡油，使用100×油鏡進(jìn)行細(xì)致觀察。

玻片放置在玻片臺(tái)上并以卡尺固定后，首先以10×目鏡、20×物鏡進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)疑為抗酸桿菌的熒光桿狀物質(zhì)，使用40×物鏡確認(rèn)。在暗背景下，抗酸桿菌發(fā)出黃色熒光，呈桿狀略彎曲。

對(duì)于自己配制或商品化的染色試劑均要監(jiān)測染色液的質(zhì)量，每次制備或購買一批新的染色液之后，須使用未經(jīng)染色的已知陽性和陰性涂片進(jìn)行染色、鏡檢，并記錄結(jié)果。并在效期內(nèi)使用，嚴(yán)禁使用過期的染色試劑。

選取痰標(biāo)本中膿性、干酪性部分制備痰膜（圖3-2）。

制備適宜厚度的痰膜，將已涂抹痰膜并干燥的玻片放置在報(bào)紙上，若透過痰膜不能分辨報(bào)紙上的5號(hào)字則表明該玻片涂抹過厚，若透過痰膜能夠非常清晰地辨別報(bào)紙上的字則表明痰膜涂抹過薄（圖3-3）。

萋-尼氏染色要進(jìn)行熱染，相比冷染可以提高陽性檢出率。

要保證足夠的染色時(shí)間，萋-尼氏染色方法初染液加熱出現(xiàn)蒸汽后保持5分鐘，熒光染色方法初染液染色至少15分鐘。

每批染色時(shí)要加入1張陽性和1張陰性涂片作為質(zhì)控片對(duì)染色過程及染色劑進(jìn)行質(zhì)量控制。

萋-尼氏染色鏡檢的涂片肉眼觀察染色后的痰膜應(yīng)呈均勻亮藍(lán)色，無紅色斑塊（見圖3-4）。熒光染色涂片呈黃色。

確保顯微鏡的功能正常。

按照結(jié)果報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)仔細(xì)觀察足夠的視野數(shù)，萋-尼氏染色方法鏡檢時(shí)，首先應(yīng)從左向右觀察相鄰的視野。當(dāng)玻片移動(dòng)至痰膜一端時(shí)，縱向向下轉(zhuǎn)換一個(gè)視野，然后從右向左觀察，依此類推。

通常20mm的痰膜，使用100×油鏡，每行可觀察約100個(gè)視野。仔細(xì)觀察完300個(gè)視野，一般需要5分鐘以上。報(bào)告1+時(shí)至少觀察300個(gè)視野，報(bào)告2+時(shí)至少觀察100個(gè)視野，報(bào)告3+、4+時(shí)至少觀察50個(gè)視野。熒光染色方法鏡檢報(bào)告陰性、實(shí)際條數(shù)、1+、2+至少觀察50個(gè)視野，3+及以上的陽性結(jié)果至少觀察20個(gè)視野。

鏡下尋找含有大量炎性細(xì)胞存在的區(qū)域，若僅觀察到含有上皮細(xì)胞的區(qū)域往往不能檢出抗酸菌（圖3-5）。

每月定期匯總分析反映痰涂片鏡檢工作的質(zhì)量指標(biāo)，連續(xù)監(jiān)測各指標(biāo)，指標(biāo)值出現(xiàn)明顯變化應(yīng)立即查詢?cè)颍⒈M快解決（圖3-6、圖3-7）。

痰涂片鏡檢質(zhì)量指標(biāo)包括初診患者痰涂片鏡檢陽性率、初診患者涂片中低陽性級(jí)別（實(shí)際條數(shù)/300視野、1+）結(jié)果比例、隨訪患者痰涂片鏡檢陽性率、痰涂片鏡檢周轉(zhuǎn)時(shí)間等。

初診患者痰涂片鏡檢陽性率=初診患者痰涂片鏡檢陽性片數(shù)量/初診患者痰涂片鏡檢片總數(shù)量

初診患者涂片中低陽性級(jí)別結(jié)果比例=初診患者低陽性級(jí)別（實(shí)際條數(shù)/300視野、1+）結(jié)果的痰涂片數(shù)量/初診患者陽性痰涂片總數(shù)量

隨訪患者痰涂片鏡檢陽性率=隨訪患者痰涂片鏡檢陽性片數(shù)量/隨訪患者痰涂片鏡檢片總數(shù)量

痰涂片鏡檢周轉(zhuǎn)時(shí)間=自實(shí)驗(yàn)室收到痰標(biāo)本后至實(shí)驗(yàn)室報(bào)告痰涂片鏡檢結(jié)果的時(shí)間間隔