3.1　抗性淀粉的來源、分類和結構

3.1.1　抗性淀粉的來源和分類

抗性淀粉的抗酶解性是由于其內部的雙螺旋在較強的氫鍵及范德華力作用下形成晶體結構，該結構降低了抗性淀粉的易損性表面積，有效阻止酶靠近淀粉的D-葡萄糖苷鍵，從而減少淀粉酶活性基團與淀粉分子結合的機會。2009年國際官方分析化學家協會（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）將抗性淀粉劃歸為膳食纖維。依據抗性淀粉的來源和特殊的酶抗機制可細分為物理包埋淀粉RS1、抗性淀粉顆粒RS2、回生淀粉RS3、化學改性淀粉RS4、直鏈淀粉-脂質復合物RS5。表3-1是常見食品中的RS含量。

RS1，即物理包埋淀粉（physically inaccessible starch），RS1淀粉在谷物和種子的胚乳中合成，淀粉顆粒被蛋白質和細胞壁包裹，這種物理結構阻礙了淀粉消化，從而降低了生糖反應。當淀粉以全谷物的形式進行蒸煮時，豆科植物種子的細胞壁和谷物的蛋白質阻礙水分滲入淀粉，淀粉無法得到充足的水分進行膨脹和糊化，因此不易與淀粉酶結合發生水解作用。此外，細胞壁和蛋白質作為一種物理屏障，也阻止消化酶的靠近和水解，使得部分淀粉不能在小腸內被消化吸收而進入結腸，這類淀粉被稱作RS1。RS1主要存在于全部或部分碾磨的谷物、種子、根莖和豆類中。加工時的粉碎、碾磨及飲用時的咀嚼等物理動作可改變其含量。RS1具有酶抗作用是由于酶分子很難與淀粉顆粒接近，并不是由于淀粉本身具有酶抗性能。抵抗酶結能力弱，可在小腸中緩慢降解，僅部分可被消化吸收。在正常蒸煮條件下，RS1具有熱穩定性，因此可以將其廣泛應用到傳統食品中。

RS2，即抗性淀粉顆粒（resistant granules）或生淀粉，主要存在于水分含量較低的天然淀粉顆粒中，如高直鏈玉米淀粉、生馬鈴薯和綠香蕉，它們都含有B型或C型結晶包埋結構，緊密排列的分子結構使消化酶無法接近淀粉從而使RS2具有抗性，因此，蒸煮、粉碎等加工方式會提高消化酶的作用效能從而使抗性淀粉含量降低。經過蒸煮，大部分淀粉經糊化作用會失去B型和C型結晶結構，成為快消化淀粉，如烤馬鈴薯和熟香蕉。然而，高直鏈淀粉能夠產生大量的直鏈淀粉和支鏈淀粉的長鏈，即使經過高溫蒸煮其結晶結構也不易被破壞，這種淀粉的糊化溫度高于水的沸點，因此在蒸煮的過程中，淀粉的晶體結構不發生改變，依然保持抗消化酶水解的特性。

RS3，即老化回生淀粉（retrograded starch），這一類淀粉是由食品加工過程中發生回生作用而形成的，如冷卻的馬鈴薯和回生的高直鏈玉米淀粉等。淀粉類食物在冷凍條件下，淀粉會發生回生作用，在回生過程中直鏈淀粉分子和支鏈淀粉的長鏈纏繞在一起形成雙螺旋結構，不易與淀粉酶結合，因此使淀粉具有抗消化特性。RS1和RS2是天然淀粉，一般情況下，食品的加工過程（如擠壓、蒸煮等）都會破壞RS1和RS2的結構，但水分含量高時，直鏈淀粉分子內部氫鍵作用加強，更容易回生形成RS3，即RS3淀粉是在加熱冷卻過程中形成的。RS3包括RS3a和RS3b兩種，其中RS3a為凝沉的支鏈淀粉，RS3b為凝沉的直鏈淀粉。RS3b的抗酶解性更強，而RS3a經過再加熱可被淀粉酶降解。RS3溶解于氫氧化鉀溶液或二甲基亞砜（DMSO）后，能被淀粉酶水解，是一種物理變性淀粉。由于回生淀粉熔點是155℃，因此RS3淀粉很穩定。RS3是一種可溶的膳食纖維，不僅具有熱穩定性，還具有較高的持水能力，使其在傳統食品的加工中具有更加廣泛的應用價值。尤其當它被作為一種原料添加在熟食制品中時，能保留抗性淀粉原有的營養功能特性。RS3具有較高的商業價值，國內外對其研究最多。

在直鏈淀粉水溶液中形成RS3的機制有兩種假說：膠束模式（micelle model）和層狀模式（lamella model）。如圖3-1所示，前者主要是直鏈淀粉在重新形成有序結構的過程中，通過彼此間相互作用使雙螺旋在鏈的一個特定區域上排列成晶體結構（crystalline structure，C），其間散布著無定形的酶降解區域。后者主要是直鏈淀粉分子在聚集形成雙螺旋結構時，發生了淀粉分子鏈的折疊，形成二維層狀的緊密結構，其中褶皺帶是無定形的（amorphous，A），而層狀的中心是結晶的（crystalline，C）。

RS4，即化學改性淀粉（chemically modified starch），主要由植物基因改造或用化學方法改變淀粉分子結構所產生，主要的修飾手段有醚化、酯化和交聯作用等，從而獲得具有淀粉酶抗性的淀粉。其中酯化作用和醚化作用改變了淀粉的結構，阻礙了消化酶的水解，從而使淀粉具有抗消化特性；交聯作用使淀粉失去了膨脹能力，在蒸煮過程中依然保持顆粒狀態，不易被淀粉酶水解和微生物發酵，從而使淀粉具有抗消化特性。常見的RS4有辛烯基琥珀酸淀粉、羧甲基淀粉、乙酰基淀粉、羥丙基淀粉、熱變性淀粉以及淀粉磷酸酯、淀粉檸檬酸酯等。RS4常用于面包、曲奇餅干等糕點類食品的工業化生產。它也是抗性淀粉商品的另一重要來源，是抗性淀粉研究中新的生長點。

RS5，即直鏈淀粉-脂質復合物（amylose-lipid complexes），是指當淀粉與脂質之間發生相互作用時，直鏈淀粉和支鏈淀粉的長鏈部分與脂肪醇或脂肪酸結合形成的復合物。當線性的淀粉鏈與脂質復合物形成螺旋結構時，脂質存在于雙螺旋的大溝和小溝中，使得直鏈淀粉的結構發生改變，由平面螺旋變成了三維螺旋，這種復合物不溶于水，且具有熱穩定性特性，不易與淀粉酶結合。淀粉-脂質復合物具有消化酶抗性主要有兩個原因：①淀粉-脂類復合物的結構與支鏈淀粉分子纏繞在一起，阻礙了淀粉顆粒的膨脹，淀粉酶不能進入淀粉顆粒內部，不易將其水解；②淀粉-脂質復合物比直鏈淀粉具有更強的消化酶抗性。其中直鏈淀粉-硬脂酸復合物是一種典型的RS5，研究證實淀粉顆粒中直鏈淀粉-硬脂酸復合物的形成限制了淀粉的膨脹，并且硬脂酸包裹在淀粉顆粒表面進一步增強了RS5的酶抗性。這種抗性淀粉糊化溫度更高，熱穩定性更強，也更容易發生回生作用，而且在95～100℃條件下酶解后依然保持半晶體結構。使用脫分支的高直鏈玉米淀粉和自由脂肪酸形成的單螺旋復合物來制備RS5，抗性淀粉的含量最高可達75%。有研究將RS5定義為由不溶于水的線性聚α-1，4-D-葡萄糖形成的多糖，這種多糖不能被α-淀粉酶降解，并且聚α-1，4-D-葡萄糖可以促進結腸內短鏈脂肪酸的形成。因此，RS5可以作為預防結腸癌的營養補充劑。

3.1.2　抗性淀粉的結構

3.1.2.1　抗性淀粉顆粒表面結構

植物體中淀粉常以顆粒形式存在，不同來源的淀粉形狀各異，在顯微鏡下觀察淀粉顆粒的形狀一般為圓形、卵形或多邊形。淀粉顆粒在糊化時受到破壞，直鏈淀粉溶出，并在低溫老化過程中形成雙螺旋結構，使顆粒結構發生巨大變化，導致原淀粉顆粒形狀消失，形成不規則的粗糙顆粒結構。不同來源淀粉顆粒形狀均有顯著差異，但抗性淀粉顆粒均呈現為不規則形狀，表面很粗糙，是一種近似蜂窩狀的纖維網絡結構。

研究發現，玉米淀粉顆粒表面光滑，呈不規則多邊形，直徑約20μm，表面無明顯缺陷或損壞跡象；但經淀粉酶處理后，顆粒黏合在一起，形成一種粗的、類似蜂窩狀網絡結構的抗性淀粉，這種網絡結構系由直鏈淀粉和支鏈淀粉所構成。淀粉凝沉過程中，游離直鏈淀粉鏈成螺旋狀，可使淀粉結構重組，形成致密結晶結構，增強對酶的抵抗性。

經酶脫支法制備的大米抗性淀粉顆粒失去了原淀粉的顆粒形態，表面粗糙，不規則的微粒相互黏附形成蜂窩狀纖維網絡結構。采用環境掃描電鏡（environment scanning electron microscopy，ESEM）觀察壓熱法制備的蓮子抗性淀粉顆粒表面結構，結果顯示經糊化和老化處理后，原淀粉規則的橢圓形狀消失，形成致密的塊狀結構，抗性淀粉表面展現為鱗片和溝壑狀，而不同制備工藝對抗性淀粉顆粒表面和晶體結構有不同的影響。研究也發現抗性淀粉顆粒表面形態不同主要與回生階段參與重結晶的直鏈淀粉數量有關。

3.1.2.2　抗性淀粉分子和晶體結構

淀粉作為一類天然多晶聚合物，其顆粒由直鏈和支鏈淀粉兩種主要組分組成。抗性淀粉是淀粉經改性制備而成的，其顆粒結構主要由結晶區和非結晶區交替構成。多晶體系中還存在著介于結晶和非晶之間的亞微晶結構，該結構被認為是由結晶、亞微晶和非晶中的一種或多種結構形成的。晶體性質和結晶結構等結構特性直接影響著抗性淀粉的功能特性。因此，明確抗性淀粉分子、晶體結構、物理化學性質以及淀粉生成的機制，對提高抗性淀粉品質和應用功效，進而推進淀粉工業的發展具有極其重要的意義。

目前國內外學者普遍采用紅外光譜、核磁共振波譜、X射線衍射等技術研究淀粉分子和晶體類型及結構變化。紅外光譜（infrared spectra，IR）技術對物質分子的結構研究是通過檢測分子轉動和內部原子間相對振動來完成的。淀粉的紅外特征峰對淀粉結晶、分子鏈構象以及螺旋結構的變化十分敏感，可用于檢測淀粉分子的結晶結構和分析變化規律。通過偏最小二乘法（partial least square，PLS）和聯合區間偏最小二乘法（synergy interval partial least square，SiPLS）建立的蓮藕淀粉含量的近紅外光譜分析模型，實現了蓮藕淀粉含量的無損檢測。有研究采用二維相關紅外光譜技術的指紋鑒定方法分析了6種不同植物來源的淀粉在外部微擾作用下的變化，實現不同種類、產地、品種淀粉譜圖區分，為分析復雜高分子化合物提供了一種新的方法和手段。

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）是利用某些帶有磁性的原子核在外加直流磁場作用下吸收能量，產生原子核能級間的躍遷，通過縱向弛豫、橫向弛豫及自旋回波和自由感應衰減等參數研究高分子結構和性質。隨著橫向極化和磁角度旋轉技術的發展，核磁共振固相波譜的靈敏度得到了很大提高，目前核磁共振技術兼具檢測速度快、精度高、重現性好等一系列特點，已被廣泛應用于淀粉及其衍生物的分子和晶體檢測。有研究利用單脈沖-魔角旋轉技術研究小麥淀粉顆粒的結構，顯示小麥淀粉顆粒中直鏈淀粉-脂肪絡合物的質子旋轉弛豫時間明顯短于結晶淀粉，小麥淀粉顆粒是由雙螺旋淀粉鏈形成的高度結晶區域、直鏈淀粉-脂肪復合物構成的類似固態物質的區域和完全的無定形區域這三種不同的組分構成的。在比較直鏈淀粉含量為0～84%的玉米淀粉在不同水分含量下核磁共振的化學位移、相對共振強度、譜線寬度和波譜形狀的差異時，發現當淀粉水合到30%左右時，直鏈淀粉的含量明顯地影響核磁共振的相對信號強度和譜線寬度，推測水合作用后結晶度的增加和無定形組分信號的缺失是核磁共振譜線寬度變窄的原因。此外，用17O NMR技術研究淀粉／水的比率、直鏈淀粉含量、磷酸化程度以及碘化鉀對淀粉糊化的影響，發現淀粉糊化時自旋-自旋弛豫時間T2發生明顯變化，說明在糊化時高含量的直鏈淀粉導致水分子的流動性降低，高度磷酸化導致水流動性降低，伴隨糊化溫度的下降，加入碘化鉀可以有效地降低水的流動性和糊化溫度。

晶體能對X射線產生衍射效應，利用這種衍射可以測定晶態物質在原子水平上的結構。淀粉結晶結構X射線衍射圖樣呈尖峰衍射特征，而非晶和亞結晶結構呈彌散峰衍射特征。研究發現，抗性淀粉顆粒是部分結晶體，有結晶區和無定型區。X射線衍射表明，抗性淀粉晶體在空間上形成雙螺旋結構，主要有四種，A型、B型、C型和V型，回生溫度對晶體結構會造成影響，低溫會導致B型結構形成，而高溫會導致A型結構形成。不同來源的淀粉X射線衍射圖樣存在一定的差別，大麥、小麥、燕麥、玉米等谷類淀粉產生A型X射線衍射圖譜，馬鈴薯、木薯等塊莖類淀粉產生B型衍射圖譜，而綠豆、豌豆、扁豆、蠶豆等豆類和塊根類產生C型衍射圖譜。研究不同超高壓條件處理對蓮子淀粉晶型結構的影響，發現蓮子淀粉經超高壓處理后顆粒特性發生明顯變化，X射線衍射圖譜由C型向B型轉變。

Eerlingen等分離的抗性淀粉的衍射圖譜顯示B型晶體結構；13C NMR結果進一步證明抗性淀粉晶體是來源于直鏈淀粉的結晶。差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）研究也發現抗性淀粉晶體主要是由直鏈淀粉的結晶形成，因為在120～165℃之間有一吸熱高峰，這一溫度范圍是直鏈淀粉晶體的熔解溫度，而支鏈淀粉晶體在60～100℃即熔解。所以用耐熱的α-淀粉酶所分離的抗性淀粉只是直鏈淀粉的結晶。而且還發現抗性淀粉的焓變值隨其產量的提高而增大。有學者通過對高直鏈淀粉玉米淀粉、小麥淀粉、玉米粉按給定步驟形成的RS3的同質多晶型的研究發現，40℃時老化形成B型結晶，而在95℃老化則形成A型與V型結晶的混合物。差示掃描量熱分析未顯示多晶型間熔點有重要差異，T_m為140～170℃。有研究者水解玉米抗性淀粉時發現，玉米淀粉和RS4為A型結晶體，而RS3為B型結晶體。淀粉結晶度要小于RS3結晶度，且相同制備方法得到抗性淀粉結晶度與其晶體結構和含量有關。晶體類型僅基于不同粒度，與密度和硬度無關。新結晶結構的出現，也能限制淀粉酶水解。研究發現，經淀粉酶處理淀粉，抗性淀粉結晶度顯著增加，且結晶度越大，抗性淀粉含量越高。另外，研究還發現，不僅直鏈淀粉可重結晶，且被脫支支鏈淀粉會利于抗性淀粉在加熱冷卻過程中晶體結構形成。抗性淀粉抗淀粉酶水解的能力來源于直鏈淀粉結晶，直鏈淀粉在加熱、冷卻和貯藏過程中部分分子相互靠近，通過氫鍵形成雙螺旋，雙螺旋再相互疊加形成直鏈淀粉結晶。抗性淀粉也含有少量的支鏈淀粉、脂類和蛋白質。

但聚合度為多少的直鏈淀粉易于結晶參與抗性淀粉的形成又是一個很重要的研究課題。國外主要用還原末端法、凝膠滲透色譜、高效離子交換色譜和高效排阻色譜法測定抗性淀粉的分子量分布，并且單一的測定方法存在較大的誤差，人們逐漸傾向于采用多種方法相結合來測定。一般認為平均聚合度DP_n范圍在30～200。楊光等用還原末端法測得抗性淀粉的平均聚合度為50，平均分子量為8100，然后以此為依據，在一個相對小的分子量范圍內為高效排阻色譜選擇分子量標樣，最后得出抗性淀粉的分子量范圍絕大多數在6300～35000之間，平均分子量為12681，并得到了分子量分布曲線。Gidley等認為聚合度必須在10～100之間才能形成雙螺旋。Eerlingen等研究發現，用β-淀粉酶處理馬鈴薯直鏈淀粉，得平均聚合度在40～610之間的片段的溶液（8.3g/L），然后在4℃下老化，用X射線衍射觀察發現所分離出來的抗性淀粉是由短鏈（平均聚合度在19～26）組成。因此可以認為RS3主要是由一些短結晶片段構成。