第二節 抗中性粒細胞胞漿抗體的檢測及其意義
ANCA是一種以中性粒細胞和單核細胞胞漿成分為靶抗原的自身抗體,1982年由Davies等人首先發現,但直到1985年認識到它與原發性小血管炎的聯系后才于臨床受到重視。以乙醇固定的正常人中性粒細胞為底物,應用間接免疫熒光法檢查,van der Woude等人發現重癥WG(即GPA)患者血清中存在著胞漿型ANCA,即cANCA;Savage等人隨后又發現MPA患者血清中存在著另一種ANCA——環核型ANCA,即pANCA。20世紀80年代后期的大量研究證實,ANCA化驗對上述原發性小血管炎的診斷具有重要意義。20世紀90年代初期,隨著ANCA特異性靶抗原的發現,用此特異抗原進行ELISA檢查ANCA即應運而生,并逐漸成為國際通用的檢查方法。
一、ANCA的檢測技術及注意事項
(一)間接免疫熒光
IIF法是最先應用且目前仍常應用的經典ANCA檢測法。應用乙醇固定的白細胞可產生兩種熒光形態:在胞漿中成粗大顆粒狀、不均勻分布者稱為cANCA,熒光沿細胞核周圍呈線條狀分布者稱為pANCA。
應用IIF法時應注意:①應選用健康人肝素抗凝的外周血分離白細胞,其中除ANCA的靶細胞中性粒細胞和單核細胞外,還應包括淋巴細胞和嗜酸性粒細胞,后兩者可作為內參照物。淋巴細胞可用來判斷自身抗體是否為中性粒細胞和單核細胞所特異,從而幫助鑒別pANCA和ANA:pANCA只識別中性粒細胞和單核細胞,而ANA則同時還識別淋巴細胞的細胞核。嗜酸性粒細胞可幫助判斷熒光強度及判斷制片是否成功。嗜酸性粒細胞內有粗大均勻一致的顆粒,在紫外光激發下可產生暗黃綠色的均勻一致的自發熒光,由此可以幫助判斷制片是否成功,細胞形態是否滿意;以嗜酸性粒細胞的自發熒光為基礎,并與其比較,可確定ANCA熒光亮度。②每次檢測均應設陰性對照、cANCA和pANCA的陽性對照,并兩人雙盲讀片來判斷結果。目前已有商品化的試劑盒,操作簡便,質量也多有保證。
IIF無法判定ANCA的特異靶抗原,已知cANCA主要靶抗原為PR3,pANCA主要靶抗原之一為MPO,但是兩者均同時具有其他靶抗原,特別是pANCA。另外,pANCA和ANA很難區分,尤其當兩者并存且ANA滴度較高時,可相互掩蓋,難以鑒別,因此單獨應用IIF法檢測ANCA(特別是pANCA)并不可靠。目前部分商品化的IIF-ANCA試劑盒除含有中性粒細胞外,還同時配備了鼠肝切片或喉癌上皮細胞用以鑒別ANCA和ANA。
(二)抗原特異性酶聯免疫吸附法
將特異性的抗原(如MPO、PR3等)直接包被于酶標板上,再檢測血清中的抗體。隨著ANCA特異性靶抗原逐一發現,這種方法在20世紀90年代得以迅速推廣。由于不同抗原特異性的ANCA往往和臨床上不同的疾病或臨床綜合征相關,抗原特異性ELISA則顯示出其優點,該方法更敏感、更特異,可直接用于協助臨床診斷和分類,在指導治療、判斷復發上意義重大。
用純化抗原包被酶標板時,不可避免地會影響蛋白質分子三維結構,而抗PR3抗體和抗MPO抗體均主要識別抗原的三維立體構像,因此,可能影響試驗敏感性。為克服這一缺點,目前檢測抗PR3抗體已常用夾心ELISA法。該方法首先以純化的抗PR3單克隆抗體作為固相蛋白包被酶標板,然后加純化的PR3或含有PR3的粗抗原,實際上相當于將PR3在酶標板上親和層析并保持了其蛋白質的立體構像。國內外研究均證明夾心ELISA法檢測抗PR3抗體的敏感性更高。
二、臨床意義
ANCA是診斷AAV的重要指標,特異性、敏感性均較好。晚近歐洲多中心聯合研究結果證實,如cANCA合并抗PR3抗體陽性或pANCA合并抗MPO抗體陽性,則診斷AAV的特異性可以達到99%。
關于ANCA對于判斷病情的活動性和復發的價值目前還存在廣泛爭議,部分ANCA陽性的患者在疾病進入緩解期后ANCA滴度雖有下降,但仍然長期維持陽性。最近一項針對156名AAV患者的多中心前瞻性研究發現,ANCA水平的變化與病情緩解或復發無關。因此,目前認為,ANCA雖然是AAV的特異性診斷學指標,但單憑其水平的高低變化不足以判斷疾病的活動性和進行治療決策。
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