1.1.2 ELISA實驗準備

1．酶標抗體的制備

常用的酶標抗體可通過在生物試劑公司購買得到。如需制備酶標抗體，則需根據(jù)實驗需要選擇適宜的酶及標記方法。

目前常用于標記的酶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AKP）、β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase）、葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase, GOD）、酸性磷酸酶等。其中HRP和AKP最為常用。HRP的作用底物為H2O2，在適宜pH及供氫體（即色原底物，如OPD、TMB及ABTS等）存在的情況下，可發(fā)生迅速而專一的顯色反應，如使用OPD，則顯橘黃色，TMB顯黃色，ABTS顯藍綠色。AKP是通過催化磷酸酯水解釋放出無機磷酸而顯色，或通過水解產(chǎn)生的磷酸與鉬酸反應生成磷鉬酸，然后在還原劑的作用下對生成的藍色終產(chǎn)物進行測定。

2．固相載體的選擇

目前大多數(shù)實驗室中最常用的固相載體為96孔聚苯乙烯酶標板，該材料具有價格低廉、蛋白吸附力強、操作簡便等優(yōu)點。另外，還可選擇纖維素、交聯(lián)右旋糖苷、聚丙烯酰胺等材料制成的酶標板。

3．抗原或抗體的包被

通常抗原或抗體通過物理吸附作用被結(jié)合在固相載體上。目前常用的包被條件如下：用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液（例如，15mmol/L Na2CO3, 35mmol/L NaHCO3, 0.1% NaN3）將抗原或抗體稀釋至1～100μg/mL, 4 ℃濕盒中包被過夜或37 ℃濕盒中包被3h。

4．ELISA清洗液的配制

通常使用的ELISA清洗液為PBS-T緩沖液，即1×PBS（pH 7.2）-Tween20（體積分數(shù)0.05%）。

5．ELISA實驗結(jié)果的判定及表示方法

ELISA實驗可通過目測法完成結(jié)果的定性判定，進一步可通過酶標儀測定光吸收值，以O(shè)D值表示定量結(jié)果。可先用梯度濃度的標準待測抗原的OD值繪制標準曲線，可由標準曲線方程計算得到未知樣品中待測抗原的濃度。

例如，使用IL-17（白細胞介素-17）ELISA試劑盒檢測人血液樣品中IL-17的含量，測定前用IL-17標準品蛋白進行ELISA測定后，用OD值繪制的標準曲線如圖1-4所示。