1.1.3 ELISA實(shí)驗(yàn)方法舉例——間接法測(cè)定抗體

1．實(shí)驗(yàn)儀器、耗材及試劑

①經(jīng)純化的已知抗原。

②待測(cè)抗體溶液。

③HRP標(biāo)記的二抗。

④包被液（配方可參考前文“抗原或抗體的包被”）。

⑤ELISA清洗液（配方可參考前文“ELISA清洗液的配制”）。

⑥封閉液：10%小牛血清或2% BSA/PBS-T（BSA即牛血清白蛋白）。

⑦底物緩沖液：pH 6.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液（Na2HPO456.77g、檸檬酸5.6g，加水800mL溶解，定容至1000mL, 4 ℃保存）。

⑧終止液：2mol/L H2SO4。

⑨酶標(biāo)儀。

⑩塑料沖洗瓶。

?微量加樣器。

?96孔微量滴定板。

2．實(shí)驗(yàn)步驟

①將已知抗原用ELISA包被緩沖液稀釋至合適濃度（如5μg/mL），每孔加入100μL包被96孔微量滴定板（過(guò)量包被，每孔加入0.5μg抗原，高于酶標(biāo)板每孔的最大吸附量50～100ng抗原，形成飽和吸附），封口膜封口，置于濕盒中，4℃包被過(guò)夜。

②用PBS-T洗板3次，每次5min，棄凈洗液。

③每孔加入200μL封閉液，濕盒中室溫孵育2h或37 ℃孵育1h。此步驟用于封閉孔中非特異的吸附位點(diǎn)。

④倒掉封閉液，用PBS-T洗板3次，每次5min，棄凈洗液。

⑤加標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：用2% BSA/PBS-T對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品抗體進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑵舛确謩e為1000、500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.80ng/mL，加入標(biāo)準(zhǔn)曲線加樣孔，每孔100μL。

⑥加待測(cè)樣品：將待測(cè)樣品用2% BSA/PBS-T按一定比例稀釋?zhuān)ㄈ?∶102、1∶103、1∶104、1∶105等）后，加入待測(cè)樣品加樣孔，每孔100μL。

⑦以上下兩孔做同一待測(cè)樣品的平行孔，前兩孔作為陰性對(duì)照，僅加入100μL 2% BSA/PBS-T，其余孔依次加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品、待測(cè)樣品，置于濕盒中，37 ℃孵育1h。

⑧倒掉抗體溶液，用PBS-T洗板3次，每次5min，棄凈洗液。

⑨加入酶標(biāo)二抗（預(yù)先用PBS-T把酶標(biāo)二抗做一定比例稀釋?zhuān)靠?00μL，置于濕盒中，37 ℃孵育1h。

⑩倒掉酶標(biāo)二抗，用PBS-T洗板3次，每次5min，棄凈洗液，然后在吸水紙上拍干。

?顯色：每孔加入100μL一定比例稀釋的酶反應(yīng)底物顯色液，避光處?kù)o置10～30min。若顯色時(shí)間過(guò)短，可能會(huì)降低實(shí)驗(yàn)的靈敏性，時(shí)間太長(zhǎng)，則本底反應(yīng)會(huì)增高，最長(zhǎng)不可超過(guò)45min。

?每孔加入100μL終止液終止反應(yīng)。

?在酶標(biāo)儀中以一定波長(zhǎng)測(cè)定光吸收值。

?以測(cè)定的OD值繪制線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)，其相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)大于0.95，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線方程計(jì)算待測(cè)樣品中抗體的濃度。

知識(shí)窗

酶免疫技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用實(shí)例

作為目前生物學(xué)研究中最常見(jiàn)及成熟的技術(shù)之一，酶免疫技術(shù)，特別是酶聯(lián)免疫吸附（ELISA），被應(yīng)用于大部分分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。在ELISA的工作原理基礎(chǔ)上，有科學(xué)家發(fā)明了將ELISA與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合起來(lái)的PCR-ELISA技術(shù)。這個(gè)技術(shù)將標(biāo)記后的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物與微孔中特定捕獲探針雜交之后進(jìn)行免疫檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)精確的核酸定量。2014年，S. Santiago-Felipe及A. Maquieira等（見(jiàn)參考文獻(xiàn)[3]）研究者使用重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）代替PCR的RPA-ELISA技術(shù)，通過(guò)對(duì)食物中不同過(guò)敏原DNA的測(cè)定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)食物的安全檢測(cè)。整個(gè)檢測(cè)消耗時(shí)間較短（40min即可完成）、實(shí)驗(yàn)溫度較低（40 ℃），對(duì)儀器要求很低，目視檢測(cè)結(jié)果即可了解不同食物的安全性。圖1-5所示為不同種類(lèi)食品對(duì)不同安全檢測(cè)項(xiàng)目的重組酶聚合酶擴(kuò)增-酶免疫測(cè)試結(jié)果。圖中檢測(cè)孔內(nèi)顏色越黃，則其對(duì)應(yīng)的食品內(nèi)過(guò)敏原含量越高。