第2章 基于組織學技術方法的免疫分析技術

2.1 免疫組織（細胞）化學技術

免疫組織（細胞）化學技術（Immunohistochemistry或Immunocytochemistry），是基于抗原抗體特異性結合反應及組織（細胞）化學的呈色反應原理，將顯色劑（如酶、熒光素、同位素、金屬離子等）標記的特異性抗體結合到組織或細胞的特定抗原上，從而對待測抗原進行定性、定位及定量測定的一項技術。因這種方法可對各種抗原物質（如蛋白質、多肽、激素等）進行組織或細胞原位的分布、表達豐度及細胞和亞細胞定位分析，因此在生物、醫藥等眾多領域得到廣泛使用。

根據標記物的不同，免疫組織（細胞）化學技術可分為免疫熒光組織（細胞）化學技術、免疫酶組織化學技術、親和免疫細胞組織化學技術、免疫鐵蛋白技術、免疫金（銀）細胞組織化學技術、免疫電鏡技術等。根據染色步驟不同，可以分為直接法和間接法。不同的免疫細胞組織化學技術，各自具有獨特的試劑和方法，但其基本技術方法是相似的，都包括抗體的制備、組織材料的處理、免疫染色、對照實驗、顯微鏡觀察等步驟。

免疫組織（細胞）化學技術適用于組織樣本（如用組織樣本制作的冰凍或石蠟切片）、單層生長的細胞（如細胞爬片）、懸浮細胞（如細胞離心涂片）等多種待檢樣品的分析。其中組織樣本主要來源于活體組織檢查標本、手術切除標本、動物模型標本及尸體解剖標本等。為充分保存組織的抗原性，標本離體后，應立即進行固定、包埋處理（用固定液如10%中性福爾馬林溶液、4%多聚甲醛緩沖液等固定，然后進行脫水、浸蠟、包埋）或速凍后進行冰凍切片，如暫不進行制片，也可儲于液氮或-70 ℃保存。

下面將以測定小鼠脾臟中T淋巴細胞表面CD4分子為例，詳細介紹冰凍組織切片的免疫組織化學染色流程。

1．實驗儀器、耗材及試劑

①液氮。

②異戊烷。

③蒸餾水。

④OCT組織包埋劑。

⑤組織固定液：4%多聚甲醛或10%中性福爾馬林溶液。

⑥1×PBS（pH 7.2～7.4）。

⑦封閉液：2%～10% BSA/PBS溶液（或者正常小鼠血清）。

⑧大鼠抗小鼠CD4分子單克隆抗體。

⑨辣根過氧化物酶標記的兔抗大鼠二抗。

⑩蘇木素。

?梯度乙醇（50%～100%）。

?二甲苯。

?緩沖甘油。

?中性樹脂。

?光學顯微鏡。

?冰凍切片機。

?載玻片、蓋玻片。

2．實驗步驟

（1）動物臟器的取材

實驗小鼠脫頸處死，打開腹腔，快速取出脾臟，以1×PBS沖洗干凈，用干凈濾紙吸干臟器表面水分。用鋒利刀片將組織修切成合適大小，使用OCT組織包埋劑將組織固定于組織托架上，放入液氮預冷的異戊烷中速凍組織，然后轉入-20 ℃冰凍切片機內，準備切片。

（2）冰凍切片的制備

速凍的組織固定于冰凍切片機載物臺上，先修整出合適的組織切面，然后換用鋒利刀片進行切片，一般組織切面的厚度為4～6μm。用室溫的載玻片迅速覆蓋于切好的切面上，組織切面便粘貼于載玻片上。貼好的切片置于-20 ℃冰箱內保存備用。

（3）冰凍切片免疫組織化學實驗步驟

①切片從-20 ℃冰箱取出，于室溫下稍稍放置，以晾干水氣。

②使用組織固定液于室溫下固定15min。

③1×PBS沖洗，5min×3次。

④3% H2O2/PBS室溫孵育15min，以消除內源性過氧化物酶的活性。

⑤1×PBS沖洗，5min×3次。

⑥封閉液封閉，室溫孵育30min。

⑦傾去封閉液，勿洗，滴加用封閉液以適當比例稀釋的一抗（需預實驗摸索，通常終濃度為1～5μg/mL），放置于濕盒中，4 ℃過夜。

⑧1×PBS沖洗，5min×3次。

⑨滴加用1×PBS以適當比例稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗（需預實驗摸索，通常終濃度為1～5μg/mL），放置于濕盒中，室溫孵育1～2h。

⑩1×PBS沖洗，5min×3次。

?滴加顯色劑（0.5mg/mL DAB, 1×PBS, 0.03% H2O2），光鏡下掌握顯色時間。自來水充分沖洗，以中止顯色反應。

?蘇木素復染30～60s。

?梯度乙醇脫水（50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% Ⅰ, 95% Ⅱ, 100%Ⅰ, 100% Ⅱ）。

?透明：在兩份二甲苯溶液中分別浸泡15min。

?中性樹脂封片。

?正置顯微鏡下觀察染色結果。

知識窗

免疫組織（細胞）化學染色在臨床疾病診斷中的應用實例

本節介紹了免疫組織化學染色的基本原理和步驟，但在實際的科研或臨床應用中，往往需要同時對2個或2個以上的待測蛋白進行組織或細胞水平定位研究。林蓁等就采用了免疫組織化學雙標技術幫助判斷腫瘤組織侵犯（見參考文獻[3]）。以DAB和快紅（Fast Red, FR）作為呈色劑的EnVision法免疫組織化學雙標技術標記腫瘤組織，腫瘤組織中腫瘤細胞被標記成棕色（DAB顯色），血管淋巴管內皮與神經纖維被標記成玫瑰紅色（FR顯色），從而幫助醫生或研究者觀察、判斷腫瘤組織中腫瘤細胞與血管、淋巴管及神經組織之間的相互關系（如圖2-1所示）。