第2章 基于組織學(xué)技術(shù)方法的免疫分析技術(shù)

2.1 免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)

免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)（Immunohistochemistry或Immunocytochemistry），是基于抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)及組織（細(xì)胞）化學(xué)的呈色反應(yīng)原理，將顯色劑（如酶、熒光素、同位素、金屬離子等）標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合到組織或細(xì)胞的特定抗原上，從而對待測抗原進(jìn)行定性、定位及定量測定的一項(xiàng)技術(shù)。因這種方法可對各種抗原物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多肽、激素等）進(jìn)行組織或細(xì)胞原位的分布、表達(dá)豐度及細(xì)胞和亞細(xì)胞定位分析，因此在生物、醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域得到廣泛使用。

根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)可分為免疫熒光組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)、免疫酶組織化學(xué)技術(shù)、親和免疫細(xì)胞組織化學(xué)技術(shù)、免疫鐵蛋白技術(shù)、免疫金（銀）細(xì)胞組織化學(xué)技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)等。根據(jù)染色步驟不同，可以分為直接法和間接法。不同的免疫細(xì)胞組織化學(xué)技術(shù)，各自具有獨(dú)特的試劑和方法，但其基本技術(shù)方法是相似的，都包括抗體的制備、組織材料的處理、免疫染色、對照實(shí)驗(yàn)、顯微鏡觀察等步驟。

免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)適用于組織樣本（如用組織樣本制作的冰凍或石蠟切片）、單層生長的細(xì)胞（如細(xì)胞爬片）、懸浮細(xì)胞（如細(xì)胞離心涂片）等多種待檢樣品的分析。其中組織樣本主要來源于活體組織檢查標(biāo)本、手術(shù)切除標(biāo)本、動物模型標(biāo)本及尸體解剖標(biāo)本等。為充分保存組織的抗原性，標(biāo)本離體后，應(yīng)立即進(jìn)行固定、包埋處理（用固定液如10%中性福爾馬林溶液、4%多聚甲醛緩沖液等固定，然后進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋）或速凍后進(jìn)行冰凍切片，如暫不進(jìn)行制片，也可儲于液氮或-70 ℃保存。

下面將以測定小鼠脾臟中T淋巴細(xì)胞表面CD4分子為例，詳細(xì)介紹冰凍組織切片的免疫組織化學(xué)染色流程。

1．實(shí)驗(yàn)儀器、耗材及試劑

①液氮。

②異戊烷。

③蒸餾水。

④OCT組織包埋劑。

⑤組織固定液：4%多聚甲醛或10%中性福爾馬林溶液。

⑥1×PBS（pH 7.2～7.4）。

⑦封閉液：2%～10% BSA/PBS溶液（或者正常小鼠血清）。

⑧大鼠抗小鼠CD4分子單克隆抗體。

⑨辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗大鼠二抗。

⑩蘇木素。

?梯度乙醇（50%～100%）。

?二甲苯。

?緩沖甘油。

?中性樹脂。

?光學(xué)顯微鏡。

?冰凍切片機(jī)。

?載玻片、蓋玻片。

2．實(shí)驗(yàn)步驟

（1）動物臟器的取材

實(shí)驗(yàn)小鼠脫頸處死，打開腹腔，快速取出脾臟，以1×PBS沖洗干凈，用干凈濾紙吸干臟器表面水分。用鋒利刀片將組織修切成合適大小，使用OCT組織包埋劑將組織固定于組織托架上，放入液氮預(yù)冷的異戊烷中速凍組織，然后轉(zhuǎn)入-20 ℃冰凍切片機(jī)內(nèi)，準(zhǔn)備切片。

（2）冰凍切片的制備

速凍的組織固定于冰凍切片機(jī)載物臺上，先修整出合適的組織切面，然后換用鋒利刀片進(jìn)行切片，一般組織切面的厚度為4～6μm。用室溫的載玻片迅速覆蓋于切好的切面上，組織切面便粘貼于載玻片上。貼好的切片置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）冰凍切片免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)步驟

①切片從-20 ℃冰箱取出，于室溫下稍稍放置，以晾干水氣。

②使用組織固定液于室溫下固定15min。

③1×PBS沖洗，5min×3次。

④3% H2O2/PBS室溫孵育15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。

⑤1×PBS沖洗，5min×3次。

⑥封閉液封閉，室溫孵育30min。

⑦傾去封閉液，勿洗，滴加用封閉液以適當(dāng)比例稀釋的一抗（需預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，通常終濃度為1～5μg/mL），放置于濕盒中，4 ℃過夜。

⑧1×PBS沖洗，5min×3次。

⑨滴加用1×PBS以適當(dāng)比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（需預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，通常終濃度為1～5μg/mL），放置于濕盒中，室溫孵育1～2h。

⑩1×PBS沖洗，5min×3次。

?滴加顯色劑（0.5mg/mL DAB, 1×PBS, 0.03% H2O2），光鏡下掌握顯色時(shí)間。自來水充分沖洗，以中止顯色反應(yīng)。

?蘇木素復(fù)染30～60s。

?梯度乙醇脫水（50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% Ⅰ, 95% Ⅱ, 100%Ⅰ, 100% Ⅱ）。

?透明：在兩份二甲苯溶液中分別浸泡15min。

?中性樹脂封片。

?正置顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

知識窗

免疫組織（細(xì)胞）化學(xué)染色在臨床疾病診斷中的應(yīng)用實(shí)例

本節(jié)介紹了免疫組織化學(xué)染色的基本原理和步驟，但在實(shí)際的科研或臨床應(yīng)用中，往往需要同時(shí)對2個(gè)或2個(gè)以上的待測蛋白進(jìn)行組織或細(xì)胞水平定位研究。林蓁等就采用了免疫組織化學(xué)雙標(biāo)技術(shù)幫助判斷腫瘤組織侵犯（見參考文獻(xiàn)[3]）。以DAB和快紅（Fast Red, FR）作為呈色劑的EnVision法免疫組織化學(xué)雙標(biāo)技術(shù)標(biāo)記腫瘤組織，腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞被標(biāo)記成棕色（DAB顯色），血管淋巴管內(nèi)皮與神經(jīng)纖維被標(biāo)記成玫瑰紅色（FR顯色），從而幫助醫(yī)生或研究者觀察、判斷腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞與血管、淋巴管及神經(jīng)組織之間的相互關(guān)系（如圖2-1所示）。