4　分子印跡快速檢測技術

4.1　分子印跡技術的原理及其分類

4.1.1　分子印跡技術的原理

分子印跡又稱為分子烙印（molecular imprinting），屬超分子化學范疇，是源于高分子化學、生物化學、材料科學等學科的一門交叉學科。分子印跡技術（molecular imprinting technique，MIT）是指制備對某一特定的目標分子（模板分子，印跡分子或烙印分子）具有特異選擇性的分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）的過程。它的起源可以追溯到20世紀40年代，著名的諾貝爾獎獲得者Pauling（1940）提出以抗原為模板來合成抗體理論，為分子印跡發展奠定了一定的理論基礎。1949年，Dickey首先實現了染料在硅膠中的印跡并提出“分子印跡”的概念。1972年德國科學家Wulff研究小組首次成功制備出對糖類化合物有較高選擇性的共價型的分子印跡聚合物，使這方面的研究產生了突破性進展。隨著1993年Mosbach研究小組創立了非共價型分子印跡聚合物制備方法（Vlatakis等，1993），分子印跡技術引起了世界矚目并迅速發展，成為了化學和生物學交叉的新興領域之一。

分子印跡技術被形象地描述為“分子鑰匙”和“人工鎖”的匹配過程，通常分為三個階段來實現分子的識別過程。第一階段，在功能單體和模板分子之間制備出共價的配合物或形成非共價的加成產物；第二階段則是對這種單體-模板配合物進行聚合；第三階段將模板分子從聚合物中除去。在第一階段中，功能單體和模板分子之間可通過共價鍵或通過處于相近位置的非共價鍵相互結合。第二階段中，配合物被凍結在高分子的三維網格內，而由功能單體所衍生的功能殘基則按與模板互補方式而拓撲地布置于其中。在第三階段，將模板分子從聚合物中除去，于是在高聚物內，原來由模板分子所占有的空間形成了一個遺留的空腔。在合適的條件下，這一空腔可以滿意地“記住”模板的結構﹑尺寸以及其他的物化性質，并能有效而有選擇性地去鍵合模板（或類似物）分子。具體原理如圖4-1所示。

4.1.2　分子印跡技術的分類

根據模板分子同聚合物單體的官能團之間作用形式不同，分子印跡技術主要分為共價法、非共價法、半共價法和金屬螯合法四類。

4.1.2.1　共價法

共價法又稱為預先組織法，其過程是模板分子與功能單體之間通過共價鍵結合，然后通過交聯劑聚合后再用化學方法打斷與模板分子連接的共價鍵，最后將模板分子洗脫出來，即可得到對模板分子具有特異性識別能力的聚合物。共價印跡包括容易發生可逆反應的MIP，通過形成硼酸酯、席夫堿、縮醛、酯或螯合物實現聯結。具有強共價印跡作用的MIP要依賴更強的酯鍵才能獲得，需專一試劑處理或通過水解才能除去模板。因此，共價法所得的復合物較穩定，選擇性也相對強于非共價法。但由于共價鍵作用力較強，模板分子自組裝和識別過程中結合和解離的速度較慢，難以達到熱力學平衡，不適宜快速識別。此外，其煩瑣的印跡和浸提過程也制約了它的應用。

硼酸酯聯結法是具代表性的共價印跡法。利用硼酸基和鄰二醇基能夠較快地形成穩定的硼酸酯，這一聯結點呈五元環結構，其剛性有利于固定模板-功能單體偶聯物的構象；而且，該聯結點較易于通過水解來斷裂。以4-乙烯基苯硼酸為功能單體，α-D-吡喃甘露糖苷為模板分子，經過縮合反應可形成共價復合物，通過交聯聚合得到聚合物，經磨碎后用甲醇和水混合溶劑水解處理以除去模板，獲得留有兩個硼酸基團的印跡孔穴，形成具有特異性識別模板分子的手性MIP，可用于拆分模板分子的外消旋混合體（郭逸蓉，2010）。

除了硼酸酯類外，目前常用的能進行可逆共價聯結體系僅局限于席夫堿（Wulff，1982）、乙縮醛/縮酮（Shea等，1986），但這兩個聯結體的鍵合過程都比較緩慢，限制了其適用范圍（Marty等，2005）；而且，由于這些模板-功能單體共價復合物對水敏感，不能用懸浮聚合和乳液聚合的方式進行印跡制備。因此，共價型印跡法的應用領域相對狹窄，發展較為緩慢。

4.1.2.2　非共價法

非共價法，也稱為自組裝法，其過程是模板分子與功能單體和交聯劑混合，通過非共價鍵結合在一起，制成具有多重作用位點的分子印跡聚合物（Mayes等，2005）。這些非共價鍵包括離子鍵、氫鍵、金屬配位鍵電荷轉移、疏水作用以及范德華力等，其中以氫鍵應用最為廣泛（Siemann等，1996）。由于非共價作用的多樣性，在印跡過程中可同時使用多種功能單體，以及用簡單的萃取法便可去除模板分子等特點，使得非共價法比共價法適用性更強。但是該方法也有一些不足之處，比如為了使模板和單體的特異作用最大化，通常實驗者要摸索很多條件來減少非特異性作用，且不同的模板需要采用的合成細節不同，使合成變得困難。

4.1.2.3　半共價法

該方法是將共價聚合和非共價聚合的方法結合起來制備分子印跡聚合物的方法，又被稱為“犧牲空間法”。該方法中，首先功能單體通過共價鍵與模板分子形成主客體配合物，然后再通過與交聯劑的共聚作用形成的分子印跡聚合物，通過一定方法除去模板分子后，形成的印跡聚合物對模板分子的再次吸附不是通過共價鍵作用，而是通過非共價鍵作用，這樣就大大提高了印跡聚合物對模板分子的結合和釋放速度，同時制備條件也相應放寬，它結合了共價法產物的穩定性和各成分比例的恒定與非共價法印跡的高的動力學特點，應用廣泛。

4.1.2.4　金屬螯合法

金屬螯合作用又稱配位作用或絡合作用，通過含不飽和軌道的金屬（特別是過渡金屬）在外部配位層接受配位體上雜原子（如N、O、S）的孤對電子而形成。金屬螯合法是利用生物分子與金屬離子之間的螯合作用螯合為復合體，通過聚合反應將復合體固定在聚合物中，通過一定條件的抽提將模板分子除去。金屬螯合印跡中，金屬與配體之間的配位作用相對非共價鍵有足夠的穩定性，同時具有高度的分離因子和立體選擇性，可以通過環境條件的改變來控制配位鍵之間的結合與斷裂速度。金屬離子一方面可以自身作為模板，利用其與功能單體配位原子之間的配位作用實現金屬離子自身的印跡；另一方面，可以利用金屬離子作為功能單體的組成部分，促成能與金屬離子形成配位鍵的分子（如生物大分子）的印跡。自20世紀70年代，日本學者Nishide等（1977）首次報道了金屬離子印跡的螯合樹脂后，已有過渡金屬離子、重金屬離子以及金屬配合物如Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Cd²⁺、Fe³⁺、Pb²⁺等（Dhruv等，2009；Singh等，2010；Farid等，2012；Mohammad等，2013；Barciela-Alonso等，2014），被用作為模板分子而成功制備出了金屬離子印跡聚合物。以金屬離子調控的印跡法是利用金屬配位作用同時聯結模板分子和功能單體進行印跡聚合物的制備，該印跡的復合體一般包括：模板分子-金屬離子-可聚合的配位體。眾多研究表明，這類金屬配位復合體的引入明顯增強了模板分子與功能單體的相互作用，從而提高了有機化合物（特別是多肽類、糖類、血清蛋白等生物分子）MIP的印跡效率和識別選擇性（Li等，2009；Chou等，2009）。