第二節 參與小曲白酒釀造的微生物
微生物分類的方法很多，主要是按生物的界、門、綱、目、科、屬、種的順序進行分類。由于學派的不同，分類方法也不同。微生物分類，對研究微生物價值很有必要。固態小曲白酒所用的根霉菌、酵母菌同屬真菌類，但它們有根本的區別，更不能混合培養。
從廣義上講，生產小曲白酒微生物系統是復雜多種的，歸納起來有霉菌、酵母菌、細菌三大類。
一、小曲中的微生物
1.霉菌
自然培養小曲中的霉菌有根霉、毛霉、米曲霉、黑曲霉等，以根霉為主，過去有人認為自然培養小曲中的霉菌以毛霉和曲霉為主的說法是錯誤的。
（1）根霉 根霉是霉菌類的一種，環境適應性很強，生長極為迅速，空氣中存在著大量的根霉孢子。自古以來，我國民間釀造甜酒（俗稱醪糟）所用的小曲（藥曲）中，主要微生物就是根霉菌。傳統川法小曲白酒釀造就是使用這種曲。
（2）小曲根霉研究 根霉在生長繁殖過程中，分泌出大量的淀粉糖化酶，能將淀粉糖化。所以，根霉是小曲白酒的重要糖化菌種。在小曲中，有的根霉菌種幾乎接近純種，如邛崍米曲、廈門白曲。中國科學院微生物研究所曾對全國100多個小曲品種取樣鑒定，有86%的小曲中全是根霉菌種，并且分離選育獲得AS3.851，AS3.852，AS3.866，AS3.867和AS3.868等多株優良根霉菌種；貴州輕工科研所、四川省糖酒公司還分別選育出了Q303和邛崍3號、5號根霉菌種，為全國各地小曲白酒純種制曲，提高出酒率打下良好的基礎。
（3）根霉的形態特征 根霉是藻狀菌綱、毛霉目、毛霉科、根霉屬的微生物。根霉的菌絲沒有分隔，一般認為是單細胞真菌。根霉在試管或平板等固態培養基上培養時，生長匍匐菌絲，且氣生菌絲叢生而呈棉絮狀，部分菌絲向下生成假根吸收養料；從假根著生處，向上生出直立的孢子囊柄，柄頂端膨脹成圓形的囊，稱為孢子囊，里面有許多孢子，稱為孢囊孢子；成熟的孢子從破裂的囊壁中釋放出來，散布到各處進行新的繁殖。值得注意的是：根霉菌絲呈比較粗的管形狀、無隔膜；菌絲開始為白色，逐步變成灰色、褐色直到黑灰色，并大多形成黑色孢子。但在液狀培養基中培養時，則難以見到氣生菌絲和孢子，通常呈現繞纏于一起的菌絲體。在加水量較少的半固態培養基上培養時，有時也能在表面看到氣生菌絲和少量孢子。
（4）根霉的綜合特性 根霉菌的特性是在生命活動中，會分泌出大量淀粉酶能將淀粉轉化成糖。所以，根霉菌是釀制固態小曲白酒不可缺少的糖化菌種。
用于制小曲的根霉菌，要求生長迅速、適應環境的能力較強，即在較粗放的條件下也能繁殖產酶，能產生一定量的乳酸等有機酸，成曲的糖化力較強。根霉的綜合特性如下：
①根霉適于在生料上生長、產酶。由于根霉難以分泌酸性羧基蛋白酶（羧肽酶），故不能分解經加熱的變性蛋白，所以根霉在熟料上的生長和產酶效果遠不及生料曲。用同一種根霉菌株培養的生麩皮曲和熟麩皮曲，前者糖化酶活力比后者高約62%。
②根霉具有產乳酸等有機酸的能力。根霉產有機酸的能力遠強于米曲霉等霉菌。根霉菌株產酸的種類與該菌株自然分布狀況有關，通常，凡產乳酸量多的根霉菌株，大多分離于小曲；而產延胡索酸較多的根霉菌株，則多分離自五谷。根霉所產的乳酸為L-型乳酸，易被人體及微生物直接利用，故在醫藥上也有廣泛的用途。在小曲發酵過程中，應使酒醅保持適宜的酸度，以有效地抑制雜菌繁殖和有利于根霉及酵母菌的生長和作用。若在發酵初期為根霉菌創造有利的條件而迅速產生一定量的乳酸，則有利于形成足量的乳酸乙酯，以保證成品酒的獨特風格。
③根霉菌能與其他菌類混合培養，能在小曲中與細菌、酵母等“共棲”，并充當主要菌。相比之下，曲霉若與細菌、酵母等混合培養時，則難以生長旺盛。
④根霉菌具有邊繁殖、邊糖化、邊發酵的特性。小曲白酒的生產過程，通常是將很少量的小曲拌入蒸熟的原料，經堆積、保溫，進行培菌糖化，再進行邊生長、邊糖化、邊發酵，而且能使三者之間的速度保持相對協調的平衡，并且不至于污染雜菌，這種性能和作用方式是較為獨特的。
（5）常見根霉的性質 自然培養小曲中常見的根霉有河內根霉、黑根霉、米根霉、白曲根霉、中國根霉、德氏根霉、臺灣省根霉、日本根霉及爪哇根霉等。它們在生長的適應性、生長特征、糖化力強弱及代謝產物等方面有所差異。
例如河內根霉具有一定的液化力，具有較強的糖化力和產有機酸的能力，尤其能形成較多量的乳酸。黑根霉的菌叢粗壯，能生成富馬酸，但其糖化力較低。在水分大、品溫高時，黑根霉會大量繁殖，被視為影響小曲糖化力的有害菌。米根霉的菌絲呈白色至黑褐色，孢子呈灰白色。白曲根霉的適應能力較差，但其糖化力及產乳酸等有機酸的能力較強，并具有一定的產酒能力，故被用于米糠小曲，在培制散曲時也用得較多。中國根霉的孢子呈鮮灰色，糖化力及產有機酸的能力均較強。爪哇根霉的菌叢呈黑色，具有較強的糖化力。上述根霉的生長適溫，多在25～40℃；作用的適溫為45～55℃；最適pH值為4.5～5.5。
根霉菌廣泛存在于自然界，小曲、大曲、五谷、環境等都可分離出根霉菌，釀酒工作者不斷尋找、選育適用于小曲白酒生產的優良根霉菌株，是提高小曲白酒產、質量的重要保證。
2.酵母菌
酵母菌是一種單細胞微生物，屬真菌類。早在4000多年前的殷商時代，我國人民就開始用酵母釀酒。在自然界中，酵母菌主要分布在含糖較高的偏酸性環境中，在蔬菜和水果的表面，在鮮花蕊中以及釀酒廠周圍環境和果園土壤中存在較多。我國民間制造的米曲、糠曲、麥曲中，也有相當數量的酵母菌。
（1）酵母形態 釀酒用酵母，細胞形狀一般為橢圓形、卵形、球形，特殊的還有臘腸形、胡瓜形、檸檬形、錐柱形及絲狀形。細胞大小平均在（7～8）μm×（5～6）μm，大的10μm×8μm，小的僅3.0μm×2.2μm。
（2）酵母性質 在自然界中，酵母菌主要分布在含糖量較高的偏酸性的環境中，如水果、蔬菜、酒廠周圍及土壤中存在有較多的酵母菌。它是以無性繁殖和有性繁殖兩種方式傳種接代，以無性繁殖為主。酵母多數是以出芽法進行繁殖，即細胞經出芽生成芽體后，進行細胞核分裂，待芽體成熟后，自母體脫落，形成新的菌體。
酵母菌耐溫能力差，在50～60℃時，數分鐘就死亡。它的最適生長溫度為25～30℃，最適pH值范圍為2.2～8。當溫度在40℃時，它便會很快衰老，活性減弱，這就是小曲白酒生產在發酵過程中為什么必須將發酵溫度控制在38～40℃的道理。
酵母菌在繁殖時期需要大量空氣，屬好氣性，而在酒精發酵時便不需要空氣又屬厭氧性，所以，生產中要求“松箱緊桶”的道理就在于此。
3.細菌
在自然中，細菌種類繁多，目前已知的有1600種以上。在人們心目中，細菌是有害的，但科學技術的發展使細菌的利用日益擴大，廣泛應用于發酵工業，例如，用細菌生產乳酸、醋酸、丙酮丁醇、抗生素。20世紀70年代，又利用細菌生產氨基酸、核苷酸、維生素、酶制劑等生物產品；還利用細菌生產一些多糖類物質以應用于食品工業及醫藥衛生等方面；同時在石油發酵、石油勘探、石油脫硫及細菌浸礦等領域中得到有效的應用；農業生產利用細菌進行生物防治害蟲和制成肥料；酶制劑已廣泛應用于酒精、白酒工業。
從固態小曲白酒生產的角度來看，細菌都是有害的。由于小曲白酒生產系統是開放式的，這給細菌的侵入提供了方便的條件，如何在生產中減少細菌對生產的污染，是古往今來一直探討的課題。
（1）細菌形態特征 細菌是單細胞微生物，其形態有三類：桿狀、球狀、弧狀，又稱桿菌、球菌、弧菌，而球菌又分單球、雙球、四聯球和葡萄球菌。
細菌的細胞大小隨種而異。一般只有幾微米。如球菌為?0.5～2μm；桿菌一般長1～5μm，寬0.5～1μm。侵入酒類生產的細菌絕大部分是桿菌，但發酵糟和配糟中卻以球菌占優勢，而發酵后期桿菌占統治地位，如乳酸菌。
細菌的菌落多數是表面光滑、濕潤、半透明或不透明的，有些還具有各種顏色，菌落一般較小。細菌以分裂方式繁殖。
在小曲白酒生產中，所謂“雜菌污染”，就是細菌的污染，而且危害極大，但主要是乳酸菌、醋酸菌等污染危害最大。
（2）乳酸菌 乳酸菌是自然界中數量最多的一類菌。它在小曲白酒生產的配糟、發酵糟內產生大量乳酸和乳酸乙酯。所以，要盡量防止它的侵入，否則將會使糟醅生酸量過大而影響產酒率和酒質。酒中乳酸含量太大，會使酒有餿味、酸味和澀味，乳酸乙酯過量會使酒呈青草味。乳酸菌對生產的污染，與小曲白酒的開放式多界面生產方式是分不開的。所以搞好衛生工作，防止過量乳酸菌入侵，對提高白酒質量和出酒率極為重要。它對生產的污染有以下三個途徑。
①乳酸菌的作用
②異乳酸菌的作用
③假乳酸菌的作用
乳酸菌多是嫌氣性桿菌，生成乳酸的能力強；而且白酒生產的發酵糟內多是異乳酸菌（乳球菌），它是偏嫌氣性或好氣性，能將己糖生成乳酸、酒精及二氧化碳。
（3）醋酸菌 醋酸菌也稱乙酸菌，種類繁多，是氧化細菌的重要菌種。在溫度、時間、培養條件不同的情況下，其形態差別很大，有球形、鏈球形、長桿形、短桿形等。它的產酸能力也很強，特別對酵母菌殺傷力很大，當在固態白酒中的條件下，勢必感染部分醋酸菌，將部分糖轉化成酸。
雖然醋酸是白酒的香味成分之一，同時也是酯類物質的承受體，還是丁酸、己酸及其酯類生成的前驅物質。但是，如果白酒中醋酸超量，將會使酒呈刺激性酸味，最主要的是會嚴重阻礙發酵的正常進行。因為固態小曲白酒生產不是醋酸不足，而是過剩。它的作用反應如下：
（4）丁酸菌 也叫酪酸菌。種類較多，一般呈紡錘形并且游動；有惡臭、汗臭和水果腐敗臭味。它特別能耐高溫，但耐酸性差。在小曲白酒生產中，污染最多的是在制造麩曲的堆積工序，如果不按時翻拌排潮和白酒生產停產時間太長，丁酸菌大量繁殖，不但影響麩曲的質量，而且嚴重影響新渣的出酒率，稍有忽視將會造成很大損失，還會引起酒質變壞。
生產中除上述有害菌外，還有己酸菌、黏液菌、枯草桿菌和放線菌等。這些微生物對小曲白酒生產均有嚴重影響，例如使材料發黏，制曲料板變硬，妨礙發酵正常進行等。
二、小曲制作中所用的優良菌株
目前大多使用優良的根霉和酵母菌株制強化小曲或純種的固態和液態小曲，純種散曲和液態曲是傳統固態小曲意義上的延伸。
1.根霉菌株的條件及優良菌株
（1）用于小曲培養的根霉菌株的條件 要求其生長迅速、適應環境的能力較強，即在較粗放的條件也能繁殖和產酶，能產生一定量的乳酸等有機酸，成曲的糖化力較強。
根霉菌的綜合特性如下：
①根霉適于在生料上生長、產酶 由于根霉難以分泌酸性羧基蛋白酶（羧肽酶），故不能分解經加熱的變性蛋白，所以根霉在熟料上的生長和產酶效果，遠不及生料曲。試驗證明，若在蒸熟的米飯中，添加17種氨基酸或大豆蛋白的水解液后接種根霉，則根霉的繁殖能力顯著增強。用同一種根霉菌株培養的生麩皮曲和熟麩皮曲，前者糖化酶活力比后者高約62%。
②根霉具有產乳酸等有機酸的能力 根霉產有機酸的能力，遠強于米曲霉等霉菌。根霉菌株的產酸種類，與該菌株自然分布狀況有關。通常，凡產乳酸量較多的根霉菌株，大多分離于小曲；而產延胡索酸較多的根霉菌株，則多分離自五谷。根霉所產的乳酸為L-型乳酸，易被人體及微生物直接利用，故在醫藥上也有廣泛的用途。
在小曲白酒發酵過程中，應使酒醅保持適宜的酸度，以有效地抑制雜菌繁殖和有利于根霉及酵母菌的生長。若在發酵初期為根霉菌創造有利的條件而迅速產生一定的乳酸，則可有利于形成足量的乳酸乙酯，以保證成品酒的獨特風格。
③根霉菌能與其他菌類混合培養 根霉菌能在小曲中與細菌、酵母等“共棲”，并充當主要菌。相比之下，曲霉若與細菌、酵母等混合培養時，則難以生長旺盛。
④根霉菌具有邊繁殖、邊糖化、邊發酵的特性 小曲白酒的生產過程，通常是將很少量的小曲拌入蒸熟的原料，經堆積、保溫，進行培菌糖化，再進行邊生長、邊糖化、邊發酵，而且能使三者之間的速度保持相對平衡，并不至于污染雜菌。這種性能和作用方式是較為獨特的。
（2）優良的根霉菌株
①AS3.866是中科院微生物所樂愛華等從小曲中分離而得到的河內根霉，其性能不錯。其糖化力和產乳酸的能力均很強，酒化酶的活力也較高，在20世紀60年代用于培制各種純種小曲。該菌株即使在熱季，產酸量也適中。
②Q303由貴州省輕工研究所陳圣龍等從小曲中分離而得。有人稱其為甜根霉曲菌株。該菌株生長迅速，糖化力及產酸能力比AS3.866更強，且性能穩定，在夏季以外的季節，能適度產酸；但酒化酶活力較弱。這是一株很優良的菌株，在小曲白酒生產中得到廣泛應用。
③四川省邛崍3號及5號根霉菌株，也是均為實踐所證明的優良根霉菌株。
④C-24和LZ-24兩株菌種，是1994年瀘州釀酒科研所從小曲中分離所得，其生長速度快，熟飯試驗的糖分比對照樣Q303分別高27%和22%，制曲效果良好，對釀酒原料適應面廣，出酒率及酒質明顯得到提高。
根霉菌廣泛存在于自然界，小曲、大曲、五谷、環境等都可分離出根霉菌，釀酒工作者不斷尋找、選育適用于小曲白酒生產的優良根霉菌株，是提高小曲白酒產、質量的重要保證。
2.優良的酵母菌株
（1）酒精酵母 產酒能力強的酵母，稱為酒精酵母。其細胞形態以橢圓形、卵形、球形最多。酒精酵母一般以無性繁殖為主，經出芽生成芽體，在細胞一端長成突起，隨后細胞核分裂，待芽體逐漸長大后，自母體脫落，形成新的個體。
以含淀粉質的原料進行小曲白酒生產，常用的酒精酵母有南陽酵母，K氏酵母，AS2.541，AS2.109，拉斯12號，拉斯M等。中國生物工程開發中心宜昌食用酵母基地（現更名為安琪酵母股份有限公司）成功地研制出耐高溫酒精活性干酵母（安琪酵母），在小曲白酒生產中廣泛應用，可將發酵溫度提高到40℃而不降低活性，能提高出酒率。
（2）產酯酵母 亦稱生香酵母。為了提高小曲白酒的酯含量以增加香味，有的廠在培制小曲時，接入若干“生香酵母”。常用的生香酵母菌株有漢遜酵母屬中的AS2.300，AS2.297，汾Ⅰ、Ⅱ及中國食品發酵科學研究所的1312，1342，1343，1274等。這些酵母屬于氧化型酵母，主要產乙酸乙酯。四川省食品發酵工業研究設計院在20世紀80年代中期從有關樣品中，分離出產酯量高達70mg/100mL的產酯酵母，在小曲、大曲酒生產中應用，獲得良好的效果。
選用產酯酵母時，不能孤立地在常規化驗數據上追求產酯能力高。有的菌種產酯能力雖強，但味道極其單調；有的菌種產酯能力較弱，卻能生成細膩復雜的香味。因此，最好能根據產品的特點，采用分別培養、混合使用的方式，使酒體香味濃郁協調。
通常，由中國科學院微生物研究所分離所得和編號的菌株，都標有“AS”字樣，菌號的第一個阿拉伯數字1，2，3，4，分別表示該菌株是細菌、酵母、霉菌、放線菌。但其他單位的菌株編號無此規律。
自然培育小曲中的微生物，是靠相互間的競爭、優勝劣汰而保持其優良性狀；現在小曲制作中使用純種，也需不斷地在生產中進行人工選育，以防止其優良性狀的退化，并不斷選育出越來越好的菌株。
三、小曲優良根霉菌株的選育、保存及使用方法實例
關于酵母的分選方法，比較簡單，可參考常見的有關參考書。以下只介紹根霉菌株的選育和保存方法。
1.根霉菌株選育
（1）實例一 據報道，1994年，瀘州市釀酒科學研究所從小曲等試樣中，以根霉培養后的外觀特征、稀碘液測菌落透明圈的直徑大小、酶活力、不同原料熟飯試驗的糖分、酸度、產酒精狀況等為指標，遴選出性能優于AS3.866和Q303的2株根霉菌，并對其反復進行物理誘變，最后選得定名為C-24和LZ-24的2株菌種。其生長速度快，熟飯試驗的糖分比對照樣Q303分別高27%和22%，制曲效果良好，對釀酒原料適應面廣，出酒率及酒質也明顯得到提高。
C-24和LZ-24的外觀特征：用土豆培養基培養3天，觀測假根、中軸、孢子囊梗、孢子囊、孢子、厚垣孢子的外形、色澤和尺寸。
不同原料熟飯的適應性試驗：以C-24和LZ-24為供試菌株，生產上常用的YG5-5，AS3.886，Q303，702這4株小曲根霉為對照菌株，用大米、玉米、糯高粱、粳高粱的熟飯為基質，接種培養后，比較它們的糖分和酸度。
①糖分 供試株明顯高于對照株，其中C-24的產糖分比YG5-5，AS3.866，Q303，702分別高11.4%，17.2%，10.5%，13.5%；LZ-24產糖分分別比上述對照株高8.8%，14.5%，8.0%，10.9%。即供試菌株的產糖分，均明顯高于對照菌株。以不同原料的熟飯相比，產糖分最高的為大米，其次為糯高粱，產糖最低的是玉米。但供試根霉菌株對這4種原料均具有較好的適應性。
②酸度 除粳高粱外，供試菌株C-24和LZ-24在大米、玉米及糯高粱熟飯上的所產酸度，均低于對照菌株，比產酸力最強的AS3.866分別低23.6%和21.8%，比產酸力最弱的Q303也分別低6.7%和4.4%。
③制曲試驗 以C-24和LZ-24為供試菌株，以YG5-5為對照菌株，以麩皮為制曲原料，每個試樣的投料量為350kg，采用與大生產相同的通風制曲工藝條件制曲，并重復2次。試驗結果如下。
a.品溫變化及菌絲生長速度 C-24和LZ-24均在曲料入池后5h品溫即開始上升，10.5h時品溫可達到35℃；而接種對照菌株的曲料，入池后6h品溫開始上升，11.5h時才達到35℃。C-24的打點時間（指肉眼能看到曲料表面開始長有菌絲的時間）為4h，LZ-24的打點時間為4.5h，分別比對照菌株早1h和0.5h。
b.感官狀況 無論是接種供試菌株或對照菌株培養的根霉曲，均呈粉末狀或小顆粒狀；色澤近似于麩皮，均勻一致，無雜色；均具有根霉曲特有的氣味。但相比之下，供試菌株曲的香氣優于對照菌株，尤以LZ-24為甚。將上述根霉菌株接種于熟米飯上培養后，飯表面均無雜色斑點，均具有甜酸味和微具酒味。但相比之下，供試菌株的性能優于對照菌株，尤以C-24為甚。
c.酶活力比較 接種C-24和LZ-24培養的根霉曲比接種YG5-5培養的根霉曲，糖化酶活力分別高44.6%和29.9%；液化力分別高39.0%和16.9%。若將供試根霉菌株和對照根霉菌株，各與等量相同的酵母分別接種后制曲，則2種酶的活力比較，也有與單接根霉菌時相似的結果。
④制酒試驗
a.試驗方案 設定以上述用C-24、LZ-24培制的根霉曲為供試曲的酒醅為A和B，用YG5-5培制的對照根霉曲的酒醅為C。以北方雜交高粱為原料。A、B、C的投糧量均為600kg/桶，用曲量均為1.8kg/桶。料水比及其他操作條件完全相同，按傳統的高粱小曲白酒的生產工藝規程進行，試驗各重復2次。
b.產酒量及出酒率 取2次結果平均數據，A產酒333.3kg，B產酒335.8kg，分別比C高3.59%和4.35%，相應的出酒率分別高1.9%和2.4%。另外，大曲生產中使用的是以AS3.866制的曲，經與上述試驗同期多次跟蹤測定，其平均每桶酒醅產酒量為325.7kg，比A、B分別低2.3%和3.0%，出酒率分別低1.2%和1.7%。
c.常規分析理化衛生指標 A、B的總酯及總酸含量略高于C；雜醇油、甲醇的含量，與C基本接近；固形物的含量，三者無明顯差異。
d.氣相色譜分析結果 A的乙酸乙酯含量為0.68g/L，比C高55.4%；B的乙酸乙酯含量與C相同。其他的酯及醇、醛的含量，三者之間無明顯差異。
e.酒質感官比較 A、B酒的味感優于C，而且A的甜味較好。
⑤討論和結論 供試菌株是采用紫外線誘變處理獲得的，應注意照射強度，以收到良好的效果。上述C-24和LZ-24菌株，已在某些廠推廣應用，效果良好。
（2）實例二 蘇州市第二米廠李金生撰文報道了從甜酒藥中分離根霉優良菌株的基本方法?，F擇要簡述如下，供參考。
①采樣 若在曲室中發現具有濃郁酒曲香味的酒藥，則當其水分降至12%左右時，可采樣裝于無菌的塑料袋中經包扎后，置于低溫干燥處保存待分離。切勿采取根霉繁殖緩慢、隨后呈明顯的酸臭氣味、曲粒疏松、表面呈雜色斑點的小曲作為分離試樣。
②分離步驟 用無菌小刀、切取上述樣品中央一小塊小曲，置于無菌研缽中研細后，注入適量無菌水加以稀釋。再按通常的平板稀釋法，做成若干稀釋平板，將其放入32℃的恒溫箱中，培養約8h后，即可看到有數條呈放射狀的菌絲開始緩緩長出、蔓延伸展。這時，可用放大鏡觀察并初步甄別，選定部位。然后，用接種針截取菌絲，不要碰及菌絲的生長起點，將菌絲移接至試管斜面培養基上。再把試管置于32℃恒溫箱中培養并注意觀察，即可得到由單條菌絲形成的純種根霉菌株。
制平板和試管斜面的培養基，以麥汁瓊脂培養基為宜。要求麥汁清亮，無與碘液呈藍色的反應，無雜質，pH值為4.5左右，濃度為12%左右。麥汁中的瓊脂加量為2%。麥汁瓊脂培養基通常在50℃左右即開始凝固。試管斜面培養基應無菌；試管口塞上棉塞，放于鐵絲筐中，上面包好牛皮紙后，置于高壓蒸汽鍋內，經0.1MPa蒸汽滅菌20～30min后取出，冷卻至室溫。再置于30℃恒溫箱中2天，使培養基多余的水分揮發掉，并驗證其確實無菌。若發現表面有雜菌生長，則不得用于分離菌株的轉接。
③試管斜面根霉菌株的培養特征 在上述試管麥汁斜面培養基上，32℃下培養，應快速生長。培養約20h，匍匐菌絲生長粗壯，并形成較厚的膜層；氣生菌絲極少。菌絲均呈白色，且色澤一致，無毛絨狀的現象。
凡呈下列現象者，則為不純或不良菌株：生長緩慢，菌絲基部呈黏油狀，培養基表面呈鼓泡，且滿管都呈毛絨狀。
④根霉菌株的純度及優良性能驗證 應該對菌株進行生理、生化等試驗和測定，考察其糖化酶等酶系的活力等狀況，以全面地驗證其優劣。但在一般工廠則采取直接用菌株釀制“酒釀”的方法，來考察菌株的純度及性能。即取250g新鮮糯米，經浸泡2h并洗盡后，置于蒸飯鍋箅子的3層預濕的紗布上，隔水蒸45min（以水煮開后計時）。再將熟飯用冷開水沖淋、瀝干，裝入燒杯中。然后，從菌株試管中取1塊如黃豆粒大小的菌，研細后拌入上述米飯中，翻拌均勻，并將表面壓實。再在物料中央制成喇叭形的窩。最后，將燒杯加蓋，并置于32℃恒溫箱中培養約36h，觀察其糖化和發酵的基本狀況，以判別菌株的優劣。
a.優良根霉 窩中汁液多而清亮，不鼓泡，液表面無膜生成。具有濃郁的酒香味，口感甘甜可口。經常規化驗，含有1.5%左右的酒精，糖度在38%以上，總酸在0.3%以下。
b.不純或不良菌株 糖化速度緩慢，遲遲不產生汁液。若不斷鼓泡，說明染有野生酵母；若呈強烈的酒精味，說明染有還原型酵母；若呈苦味，說明染有細菌。優良的根霉菌株，須經反復分選、考察才能獲得。故應將這項工作經常化。
2.根霉菌株的保存方法
貴州省輕工研究所陳圣龍曾撰文發表采用試管固態麩皮培養并保存優良根霉菌種的方法，具有很好的實用效果?，F擇要簡述如下，供參考。
（1）試管麩皮固態培養基的制備
①加水拌料、裝管 麩皮的加水量因麩皮粗細程度而異，通常，加水量為75%～80%。若麩皮水分太高，則滅菌后會結塊而透氣不良；若水分太低，則麩皮易于干燥。故麩皮水分必須適當，才能保證根霉菌的正常生長。
麩皮加水拌勻后，可用小藥勺裝入試管。通常，規格為15mm×150mm的試管，裝料高度為10mm。裝料后，用試管刷將附著于管口及管壁的物料清理掉，以免正式接種培養時污染、生長雜菌。再在試管口塞好棉塞，將試管豎立裝入試管鐵絲筐中，并在上方包扎牛皮紙，以免滅菌時有水珠滴濕棉塞而在培養根霉時污染雜菌。
②滅菌 將上述裝有試管麩皮培養基的鐵絲筐放入高壓滅菌鍋內，以0.1MPa的蒸汽滅菌30min即可。
③冷卻 試管培養基滅菌結束后，應及時將其從高壓鍋中取出，將試管口朝上，直立于冷水浴中冷卻，冷水高度以不浸濕試管口的棉塞為限。若不迅速冷卻而讓其自然冷卻至室溫，則會使麩皮中的水分過量蒸發，致使根霉菌生長不良，甚至根本不能繁殖。另外，經滅菌、冷卻后的試管麩皮培養基，應及時接種培養，否則也會導致根霉菌難以生長的后果。
（2）接種、培養 按常規的無菌操作法進行接種后，將菌種放入恒溫箱內培養。培養品溫因菌株而異，例如，Q303及AS3.866菌株可控制為28～30℃。培養時間以形成大量孢子囊為準，一般為48～72h。
（3）菌種干燥 將上述培養好的菌種，置于45℃的恒溫箱中進行干燥，一般經5天即可干透。若干燥溫度較低，則干燥時間過長，不易掌握其干燥程度；故應盡可能地采取較高的干燥溫度。但也不能采取根霉的死滅溫度進行干燥。經試驗觀測，濕菌種的死滅溫度為45～50℃；而干菌種耐熱性能好，在95℃下也能存活。這與一般微生物孢子的耐熱強度是相似的，即孢子的含水量越少，其耐熱性越強。
（4）干燥菌種的保存 可將上述經干燥的試管菌種，置于玻璃干燥器中保存；也可將試管口用酒精噴燈的火焰燒熔封口后，置于常溫下保存。采用上述方法保存的根霉菌株，歷經23年之久，仍有萌發和生長的能力，并未變異和污染雜菌。貴州省輕工研究所向全國發售的優良根霉菌株，也采用上述培養基培養和保存。因其在郵寄過程中容易保存，在生產上可直接使用，并能長期保存，故頗受使用廠家的歡迎。
3.試管固態麩皮根霉菌株的使用
可將上述保存的根霉菌株，直接轉接至試管麩皮、試管麥汁瓊脂斜面或三角瓶麩皮培養基上進行培養。若需轉接至表面積或總體積較大的培養基上，則可先將無菌水加入菌種試管中，制取孢子懸濁液后再轉接。
若菌種保存期已在10年以上，則在使用前，需將其先轉接至新鮮的試管麩皮或麥汁瓊脂斜面培養基上，進行培養、活化后，再應用于生產。否則會影響菌體的正常生產，并易招致雜菌污染。
四、參與小曲白酒生產微生物的條件控制
根霉菌、酵母菌、細菌等微生物，與其他生物體一樣，在新陳代謝、生長繁殖的生命活動中，受到各種環境條件的限制，在生產中，要利用它們自身特點，掌握它們的生命活動規律，使它們處在人為控制的環境條件中。
要根據不同微生物的需要和生活條件，來調節控制它們為生產服務。實現制曲、培菌箱、發酵的溫度、水分、空氣、酸度等條件的調節控制。因此，要掌握它們對碳源和酸堿度的需求，才能更好地為白酒生產服務。