3.1　方法原理

3.1.1　熒光的產生

所有電子自旋都配對的分子的電子態，稱為單重態（Singlet State），用S表示。分子中電子對的電子自旋平行的電子態稱為三重態（Triplet State），用T表示。

基態分子吸收了特定頻率輻射能量后，由基態（S₀）躍遷至第一、第二激發單重態（S₁，S₂）的任一振動能級，處于激發態的分子，通過無輻射躍遷的形式放出部分能量（轉化為分子的振動能或轉動能等）回至S₁態的最低振動能級，然后再以輻射躍遷的形式放出能量，回至S₁態的各振動能級，該過程就產生了熒光（S₁→S₀）；當S₁態與激發三重態（T₁）之間發生振動耦合，以無輻射躍遷的形式回至T₁態，并經T₁態的最低振動能級回至S₀態的各振動能級，則產生磷光（T₁→S₀），如圖3-1所示。

振動弛豫（VR）是在分子的同一電子能級中，分子由高振動能級向該電子態的最低振動能級的非輻射躍遷。振動弛豫過程的速率極大，在10^-14～10^-12s內即可完成。V=0表示基態的最低振動能級。內轉化（ic）是相同多重態的兩個電子態之間（S₂→S₁，S₁→S₀）的非輻射躍遷。體系間竄躍（isc）是指不同多重態的兩個電子態間的非輻射躍遷。

3.1.2　熒光激發光譜

熒光激發光譜是指不同激發波長的輻射引起物質發射某一波長熒光的相對效率。是通過固定熒光發射波長，掃描熒光激發波長，以熒光強度（F）為縱坐標，激發波長（λ_ex）為橫坐標，所繪制得到的曲線。

3.1.3　熒光發射光譜

熒光發射光譜通常稱為熒光光譜（Fluorescence Spectrum），表示在所發射的熒光中各種波長組分的相對強度，是通過固定熒光激發波長，掃描熒光發射波長，以熒光強度（F）為縱坐標，發射波長（λ_em）為橫坐標，所繪制得到的曲線。

圖3-2是萘的熒光激發光譜和熒光發射光譜，其激發光譜有2個峰，而發射光譜僅一個峰。

但是熒光發射光譜的形狀與激發波長無關。這是因為熒光分子發射熒光只是從第一電子激發態的最低振動能級開始，在其他激發態振動不發射熒光。

熒光發射光譜的形狀與熒光激發光譜極為相似，且呈鏡像對稱關系。這是由于基態分子中能級的分布和第一電子激發態中最低振動能級的分布情況類似。如圖3-3是蒽的激發光譜和發射光譜。

3.1.4　熒光強度與濃度的關系

熒光是物質在吸光之后所發射的輻射，溶液的熒光強度（I_f）與該溶液吸收的光強度（I_a）以及該物質的熒光量子產率（Y_f）有關，即：

I_f=Y_fI_a

而吸收的光強度等于入射的光強度（I₀）減去透射的光強度（I_t），于是有：

由朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律可知：

代入得：

由得

當abc非常小（?0.05）時，則，所以

當用摩爾吸光系數ε代替a時，得：

由上述可知，某種熒光物質在一定頻率及強度的激發光照射下，只有當溶液的濃度足夠小，對激發光的吸光度很低時，所測得溶液的熒光強度才與該物質的濃度成正比。若濃度較高，熒光強度與濃度之間的線性關系將發生偏離，有時甚至隨溶液濃度的增大而降低。

利用低濃度下熒光物質的熒光強度與濃度成正比的特點，可對物質進行定量測定。