2.2　實驗設(shè)計和方法

2.2.1　實驗設(shè)計

通過對某油田區(qū)塊的6口油井采出液調(diào)研取樣，將數(shù)個塑料桶裝滿（約5L），取樣之前通入氮氣密封，取樣后迅速運回實驗室，低溫保存，同時取深層（30cm以下）被石油污染的土壤，5點取樣，混勻后低溫－5℃厭氧保存。

其中油田采出液按照好氧條件培養(yǎng)（YHH）和厭氧條件培養(yǎng)（YH），而含油污泥則按照厭氧條件培養(yǎng)（TH），后面的數(shù)字代表取樣編號。因為有學(xué)者研究表明：油藏中的微生物群體是由微好氧菌群和兼性厭氧型以及嚴格厭氧型細菌組成的，而且油藏中的脂肪烴提供了它們存活的基礎(chǔ)^[35～39]，而且有學(xué)者從油藏環(huán)境中分離得到了好氧微生物^[70～72]，可能是因為隨著油藏的開采，大量注入水和其他物質(zhì)改變了油藏本來的環(huán)境^[35，39]。

油田采出液的厭氧富集培養(yǎng)，主要是利用油藏中內(nèi)源微生物，所用采出液和石油樣品都為內(nèi)源的，所謂內(nèi)源樣品就是對應(yīng)于各個油井編號和含油污泥編號的樣品。

具體來說，在厭氧操作箱中進行初級富集培養(yǎng)，取30mL的油田采出液（除油）和6g油、60mL滅菌無機鹽富集培養(yǎng)基充入到120mL無菌瓶中，30℃下富集培養(yǎng)（同時也做了其他溫度的相同實驗），直到各培養(yǎng)瓶中都能檢測到穩(wěn)定的甲烷產(chǎn)量，培養(yǎng)結(jié)束，初篩培養(yǎng)時間為400d，同時以滅菌和不添加油作為對照。選取400d是因為不同來源的菌群產(chǎn)甲烷能力有差異，結(jié)束時間是直到各個來源的培養(yǎng)瓶都有穩(wěn)定的甲烷產(chǎn)生。上述厭氧富集培養(yǎng)過程，需進行培養(yǎng)馴化：常溫培養(yǎng)，20d后對培養(yǎng)液下層顏色變深的培養(yǎng)瓶進行轉(zhuǎn)接，取清液，轉(zhuǎn)接4～5次，重復(fù)以上過程，得到菌液后富集培養(yǎng)。所用無機鹽富集培養(yǎng)基：KH₂PO₄ 5.0g，K₂HPO₄ 5.0g，NH₄Cl 5.0g，NaCl 1.0g，MgCl₂ 2.0g，CaCl₂ 0.1g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，硫酸亞鐵銨0.5g，維生素5mL，微量元素5mL，定容到1L，pH值7.0～7.2，刃天青1.0mg^{[37，70～72]}。

培養(yǎng)基中必須要加入營養(yǎng)物質(zhì)，因為其可以縮短室內(nèi)的培養(yǎng)進程以更好地應(yīng)用于研究。營養(yǎng)激活劑對石油烴厭氧產(chǎn)氣的影響將在以后章節(jié)進行說明。培養(yǎng)基配制具體步驟為：將培養(yǎng)基加入2L大燒杯中，加熱煮沸并不斷通入氮氣，直到培養(yǎng)基由粉色變?yōu)闊o色，從而指示整個培養(yǎng)基處于無氧狀態(tài)；停止加熱，待培養(yǎng)基冷卻后，再加入維生素和微量元素溶液，分裝于120mL厭氧培養(yǎng)血清瓶，高溫、高壓滅菌；最后加入經(jīng)過生物濾膜除菌后，添加九水硫化鈉（終濃度0.03%）和碳酸氫鈉（終濃度0.2%）^{[34～37，71，72]}，其中刃天青現(xiàn)用現(xiàn)配，密封保存，按照表2-3和表2-4配制維生素^{[41，71，72]}和微量元素^[71，72]溶液。

在厭氧條件下，處理含油污泥時，取10g含油污泥（首先測出含油污泥中的石油烴含量，方法參見2.2.2）加入100mL已高溫滅菌的富集培養(yǎng)基中，常溫初級培養(yǎng)；然后取上清液轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，其余培養(yǎng)過程和采出水的厭氧培養(yǎng)過程相似。以上實驗需經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，測量產(chǎn)甲烷量和石油烴變化。采出液的好氧培養(yǎng)類似于上述過程，不同點在于不用通氮氣和煮沸除氧，只需放入控溫搖床中培養(yǎng)，120r/min，每隔10d就要轉(zhuǎn)至新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)富集培養(yǎng)。好氧菌富集培養(yǎng)基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15～20g（固體培養(yǎng)基專用），pH值為7.1～7.2^[73]。其中，圖2-1為油田取樣及現(xiàn)場調(diào)研情況，以求更廣泛地收集樣品。進一步通過表2-5可以看出6口油井采出液和含油污泥取樣地的性質(zhì)參數(shù)。而且含油污泥的含油率為5.8%～11.3%。