2.2　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

2.2.1　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)對(duì)某油田區(qū)塊的6口油井采出液調(diào)研取樣，將數(shù)個(gè)塑料桶裝滿（約5L），取樣之前通入氮?dú)饷芊?，取樣后迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，低溫保存，同時(shí)取深層（30cm以下）被石油污染的土壤，5點(diǎn)取樣，混勻后低溫－5℃厭氧保存。

其中油田采出液按照好氧條件培養(yǎng)（YHH）和厭氧條件培養(yǎng)（YH），而含油污泥則按照厭氧條件培養(yǎng)（TH），后面的數(shù)字代表取樣編號(hào)。因?yàn)橛袑W(xué)者研究表明：油藏中的微生物群體是由微好氧菌群和兼性厭氧型以及嚴(yán)格厭氧型細(xì)菌組成的，而且油藏中的脂肪烴提供了它們存活的基礎(chǔ)^[35～39]，而且有學(xué)者從油藏環(huán)境中分離得到了好氧微生物^[70～72]，可能是因?yàn)殡S著油藏的開(kāi)采，大量注入水和其他物質(zhì)改變了油藏本來(lái)的環(huán)境^{[35，39]}。

油田采出液的厭氧富集培養(yǎng)，主要是利用油藏中內(nèi)源微生物，所用采出液和石油樣品都為內(nèi)源的，所謂內(nèi)源樣品就是對(duì)應(yīng)于各個(gè)油井編號(hào)和含油污泥編號(hào)的樣品。

具體來(lái)說(shuō)，在厭氧操作箱中進(jìn)行初級(jí)富集培養(yǎng)，取30mL的油田采出液（除油）和6g油、60mL滅菌無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基充入到120mL無(wú)菌瓶中，30℃下富集培養(yǎng)（同時(shí)也做了其他溫度的相同實(shí)驗(yàn)），直到各培養(yǎng)瓶中都能檢測(cè)到穩(wěn)定的甲烷產(chǎn)量，培養(yǎng)結(jié)束，初篩培養(yǎng)時(shí)間為400d，同時(shí)以滅菌和不添加油作為對(duì)照。選取400d是因?yàn)椴煌瑏?lái)源的菌群產(chǎn)甲烷能力有差異，結(jié)束時(shí)間是直到各個(gè)來(lái)源的培養(yǎng)瓶都有穩(wěn)定的甲烷產(chǎn)生。上述厭氧富集培養(yǎng)過(guò)程，需進(jìn)行培養(yǎng)馴化：常溫培養(yǎng)，20d后對(duì)培養(yǎng)液下層顏色變深的培養(yǎng)瓶進(jìn)行轉(zhuǎn)接，取清液，轉(zhuǎn)接4～5次，重復(fù)以上過(guò)程，得到菌液后富集培養(yǎng)。所用無(wú)機(jī)鹽富集培養(yǎng)基：KH₂PO₄ 5.0g，K₂HPO₄ 5.0g，NH₄Cl 5.0g，NaCl 1.0g，MgCl₂ 2.0g，CaCl₂ 0.1g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，硫酸亞鐵銨0.5g，維生素5mL，微量元素5mL，定容到1L，pH值7.0～7.2，刃天青1.0mg^{[37，70～72]}。

培養(yǎng)基中必須要加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因?yàn)槠淇梢钥s短室內(nèi)的培養(yǎng)進(jìn)程以更好地應(yīng)用于研究。營(yíng)養(yǎng)激活劑對(duì)石油烴厭氧產(chǎn)氣的影響將在以后章節(jié)進(jìn)行說(shuō)明。培養(yǎng)基配制具體步驟為：將培養(yǎng)基加入2L大燒杯中，加熱煮沸并不斷通入氮?dú)?，直到培養(yǎng)基由粉色變?yōu)闊o(wú)色，從而指示整個(gè)培養(yǎng)基處于無(wú)氧狀態(tài)；停止加熱，待培養(yǎng)基冷卻后，再加入維生素和微量元素溶液，分裝于120mL厭氧培養(yǎng)血清瓶，高溫、高壓滅菌；最后加入經(jīng)過(guò)生物濾膜除菌后，添加九水硫化鈉（終濃度0.03%）和碳酸氫鈉（終濃度0.2%）^{[34～37，71，72]}，其中刃天青現(xiàn)用現(xiàn)配，密封保存，按照表2-3和表2-4配制維生素^{[41，71，72]}和微量元素^[71，72]溶液。

在厭氧條件下，處理含油污泥時(shí)，取10g含油污泥（首先測(cè)出含油污泥中的石油烴含量，方法參見(jiàn)2.2.2）加入100mL已高溫滅菌的富集培養(yǎng)基中，常溫初級(jí)培養(yǎng)；然后取上清液轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，其余培養(yǎng)過(guò)程和采出水的厭氧培養(yǎng)過(guò)程相似。以上實(shí)驗(yàn)需經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，測(cè)量產(chǎn)甲烷量和石油烴變化。采出液的好氧培養(yǎng)類似于上述過(guò)程，不同點(diǎn)在于不用通氮?dú)夂椭蠓谐酰恍璺湃肟販負(fù)u床中培養(yǎng)，120r/min，每隔10d就要轉(zhuǎn)至新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)富集培養(yǎng)。好氧菌富集培養(yǎng)基：酵母粉5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15～20g（固體培養(yǎng)基專用），pH值為7.1～7.2^[73]。其中，圖2-1為油田取樣及現(xiàn)場(chǎng)調(diào)研情況，以求更廣泛地收集樣品。進(jìn)一步通過(guò)表2-5可以看出6口油井采出液和含油污泥取樣地的性質(zhì)參數(shù)。而且含油污泥的含油率為5.8%～11.3%。