2.2.2　實驗方法

（1）含油污泥和采出液的石油烴含量測定

本實驗取油田采出液時，取的是清液，為防止清液里邊有石油烴，我們取了200mL采出液，用重量法進行測定石油烴含量，通過索氏提取器，在75℃時用氯仿回流萃取，時間為6h；然后回收氯仿混合液，轉移到分液漏斗中，用8%的NaOH洗滌索氏提取器2～3次，都轉入分液漏斗中，振蕩2min，其次將上層堿液丟棄，剩下的氯仿溶液用蒸餾水洗滌3次，棄去上層水相；再次用無水硫酸鈉脫水，轉入蒸餾瓶中，常溫除去氯仿；48h后稱重，瓶子增加的重量即為石油烴含量。

注意：為防止輕組分石油烴揮發，對蒸餾瓶中的空氣進行氣相色譜檢測揮發石油烴。污泥中石油烴采取和上述方法相同的步驟，不同點是在一開始用無水硫酸鈉除去水分^[38]。

（2）微生物數量的測定

稱取100mL的采出清液和10g含油污泥，加入到無菌水中，振蕩，過濾，變成均一的懸液，對懸液進行稀釋，然后涂平板，好氧細菌稀釋倍數為10^－6～10^－1、厭氧細菌稀釋倍數為10^－4～10^－1，倒置進行好氧和厭氧培養，好氧細菌3d后CFU計數、厭氧細菌10d后CFU計數^{[38，75～86]}。好氧細菌采用蛋白胨固體培養基、厭氧菌采用富集培養基（1.5%的瓊脂）^[38，77]。

（3）石油厭氧產氣測定

① 氣體組分：安捷倫氣相色譜儀。

② 檢測器：FID200℃；氣化進樣器150℃。

③ 色譜柱：PONA彈性石英毛細柱（50m×0.2mm×0.5μm）。

④ 柱溫：初溫35℃，保留15min；以5℃/min速率升溫至200℃，保留5min^[34～37]。

取樣時先用氣體收集器從上方收集氣體，然后再用密封注射器取樣，進樣體積為0.3mL，將標準氣體用高純氮氣稀釋成不同濃度，在上述條件下進行分析，修正的面積歸一法定量氣體含量^[78]。

Varian GC-3800氣相色譜儀，色譜柱為Al₂O₃（50m×0.53mm×20μm），溫度控制條件為初始柱溫40℃，2min后到100℃，以10℃/min速率升溫至170℃，保持25min。進樣口溫度為100℃；FID檢測器溫度為150℃，高純度氦氣為載氣^[72]。

（4）石油正構烷烴和柱層析及飽和烴分析

根據石油天然氣行業標準SY/T 5119—2016《巖石中可溶有機物及原油族組分分析》及《原油族組分柱層析分析方法》，將降解前后的石油分成飽和烴、芳烴、膠質和瀝青質。將降解前后的油樣用二硫化碳進行溶解，用GC-FID（CP3800）進行模擬蒸餾分析原油濃度與組分的變化，進樣量為0.8μL，毛細管柱為CP5960柱（5m×0.53mm×0.25μm），分流進樣（1∶2）。控溫程序：起始溫度40℃，保留2min；以10℃/min速率升溫至350℃，保留10min。載氣為氮氣^[38]。

GC-MS分析：儀器為Agilent 6890N氣相色譜/5975i質譜聯用儀。彈性石英毛細柱（60m×0.25mm×0.25μm）。測試條件：進樣口溫度為300℃；柱溫（程序升溫），初溫50℃進行1min，以20℃/min的速率升溫至120℃；然后以4℃/min的速率升溫到250℃；再以3℃/min的速率升溫到310℃，維持30min。質譜EI源，70eV，照射燈絲電流為100μA，進行全掃描^[34～37]。

（5）石油烴降解率的測定

根據國家標準HJ 637—2012對降解前后的石油烴降解率進行紅外分光光度測試，紅外分光光度儀先用稱重法進行校準，而后對石油烴進行萃取，再根據萃取比換算成油類含量。首先將培養液轉移到分液漏斗中，然后酸化到pH≤2，用CCl₄洗滌3次，加入NaCl振蕩，靜置分層后，取下層萃取液加入含有硫酸鈉的玻璃砂芯漏斗中，并用真空泵抽濾，與此同時，對上層溶液再重復剛才的操作。然后將漏斗中的濾液轉移到容量瓶中，用CCl₄定容。稀釋一定倍數以后，用紅外分光測油儀確定石油烴含量^{[38，79，80]}。

（6）降解前后石油烴的黏度

根據GB/T 265—1988標準測量，測定一定體積的液體在重力下，流過一個經標定的玻璃毛細管黏度計的時間。毛細管黏度計是以博斯方程為基礎的，然后計算出動力黏度（mPa·s），就是黏度計的毛細管常數與流動時間的乘積。

（7）采出液和含油污泥中各組分及性質分析

全氮測定采用凱氏定氮法，有機質采用重鉻酸鉀比色法，全磷測定采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法，鉀、鈉采用火焰分光光度計法，碳酸根和碳酸氫根可采用雙指示劑中和法進行滴定，用EDTA滴定法測定鈣、鎂離子含量，采用原子吸收光譜法測定采出水中等微量元素的含量。

（8）細菌群落的PCR-DGGE分析

在進行細菌群落分析的時候采用聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳技術（PCR-DGGE）^[71～75]。通過對采出水和含油污泥中的細菌群落進行分析，而且經過PCR對樣品中的古菌和細菌的16S rDNA的V3區進行擴增，通過變性梯度凝膠電泳（DGGE）對微生物群落組成進行分析。下面介紹一下微生物群落的PCR-DGGE分析。

取菌液1mL進行離心操作，轉速設定為10000r/min，離心時間為1min，離心后用微量移液槍吸取上清液；重復多次操作，然后將菌體用玻璃珠破碎法進行DNA的提取，通過玻璃珠加入磷酸鹽緩沖液（120mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH值為8.0）和0.5mol/L Tris HCl（pH值為8.0）、0.1mol/L NaCl、10% SDS；在破壁儀（日本）上進行破壁30s，然后用Tirs飽和酚、異戊醇、氯仿（25∶1∶24，pH值≥7.8）、異戊醇、氯仿（1∶24）進行抽提。以上操作離心條件均為17000g，4℃，5min^[40，81]，所得DNA通過QIAGEN試劑盒進行純化后進行PCR。通過瓊脂糖膠電泳，觀察所提DNA的亮度，同時測量OD₂₆₀和OD₂₈₀值，以確定DNA的濃度，然后放－20℃冰箱保存備用^{[40，71～75]}。具體來說，電泳用1倍TAE儲備液（加瓊脂）進行瓊脂糖凝膠電泳，上樣緩沖液6×Loading Buffer中含有指示劑溴酚藍，可顯示電泳進程，表2-6為50倍的TAE儲備液配方^{[40，71～75]}。

提取DNA后，下面就要進行PCR擴增目的片段。由于后續要進行細菌群落的分析，先是對所有用具進行高溫高壓滅菌，然后離心機打開預冷至4℃，打開制冰機制冰，用紫外燈對超凈工作臺滅菌20min，取出DNA在冰上解凍，并且做空白對照，體系為20μL。有關學者提出在進行DGGE分析時，擴增片段要在500bp以下，因此，本章選用了帶GC夾的引物341F-GC和534R（由上海生工生物工程有限公司合成）（見表2-7），帶GC夾的目的就是防止雙鏈完全解開，更好地使DNA擴增片段在相應的變性劑濃度上停止，達到分離的目的^[71～75]。通過表2-8說明PCR的擴增體系，同時通過多次重復試驗，確定了本章試驗中的最佳PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環，最后72℃延伸10min。

分析細菌后，需要對產甲烷古菌也進行群落分析，首先進行PCR擴增，試驗中選擇的前引物為pARCH344f-GC，后引物為UNIV 522r，具體序列詳見表2-9^{[32～42，71～75]}。通過表2-10說明了古菌PCR的擴增體系，同時通過多次重復試驗，確定了本章試驗中古菌的最佳PCR反應條件：95℃預變性5min；95℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸1min，30個循環，最后72℃延伸10min。

變性梯度凝膠電泳分析過程主要是配制聚丙烯酰胺凝膠膠液，本實驗選用30%～70%變性劑濃度梯度的聚丙烯酰胺凝膠，如表2-11和表2-12所列。將藥品依次加入兩個離心管中，一個濃度為30%，一個濃度為70%，加入后用無菌水定溶至16mL，混合均勻，全部溶解后，每管分別加入18μL TEMED溶液和80μL 10% APS溶液；混勻，分別吸入注射器準備灌膠，注射器用灌膠器（BIO-RAD公司）固定好后向膠槽灌膠，灌滿后上方插上梳子，凝膠1h，將玻璃板固定，兩側中間要墊塑料片，做好膠槽，將其固定在制膠架上；固定好，下部要墊海綿，以防灌膠時膠液漏出，導致膠液不足。

① 電泳　首先在凝膠期間進行預電泳，因為電泳需要在60℃下進行，因此在將膠放入電泳槽前需要先加熱到60℃，待膠凝固，電泳槽中緩沖液升溫到60℃后，將膠放入電泳槽；之后用接種槍反復吹膠空；然后上樣，間隔上樣，上樣量為20μL。之后進行電泳，電泳條件為：電壓75V，時間14h。

② 染色　待電泳結束后，電泳槽緩沖液溫度冷卻至室溫后，將膠取出，打開膠槽玻璃板，輕輕去除凝膠。要注意：聚丙烯酰胺凝膠易碎，取出后放入去離子水中清洗，清洗后放入EB染色15min。

③ 成像分析　取出染色后凝膠，用去離子水沖洗染色劑，將膠放入成像系統（BIO-RAD公司）成像，保存照片用于分析^[71～75]。

（9）數據統計和分析

作圖采用Origin8.0畫圖軟件，數據分析采用SPSS統計軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL），標準差（SD）和最低顯著性檢驗（LSD）用來比較和分析各組數據之間的差異^[73]。