2.5　病毒的培養(yǎng)和計數(shù)

2.5.1　病毒的培養(yǎng)特征

（1）病毒在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征　將噬菌體的敏感宿主細胞在液體培養(yǎng)基中先進行培養(yǎng)，敏感細菌會均勻分布在液體培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁。當接種噬菌體后，敏感細菌被感染后發(fā)生裂解，原來渾濁的細菌懸濁液因此而變得透明。

（2） 病毒在固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)特征　將噬菌體的敏感細胞接種在瓊脂固體培養(yǎng)基上，形成菌落。當噬菌體被接種后，會在感染點上進行反復感染，導致細菌菌落中的細菌被裂解而出現(xiàn)空斑，這些空斑稱為噬菌斑（plague）。

2.5.2　病毒的培養(yǎng)基

由于病毒的專性寄生的習性，所以其培養(yǎng)也較為困難，必須提供活的敏感細胞，而且要求它能提供病毒附著的受體，不對侵入的病毒核酸進行破壞（沒有破壞特異性病毒的限制性核酸內切酶）。

不同種類的病毒，其培養(yǎng)基是不同的。

脊椎動物的病毒敏感細胞有人胚組織細胞、人體組織細胞、腫瘤細胞、動物組織細胞、雞鴨胚細胞，也可以用敏感動物（如猴、兔、羊、馬、小白鼠等）來培養(yǎng)病毒。不同病毒對組織的敏感性不一樣，如脊髓灰質炎病毒對人胚腎細胞最敏感，乙型腦炎病毒對鴨胚肌皮細胞及豬腎細胞最敏感。

植物病毒的培養(yǎng)可用相應的敏感植物或植物組織細胞進行。

噬菌體的培養(yǎng)，要求提供與之相應的敏感細菌，如大腸桿菌噬菌體就需要用大腸桿菌（Escherichia coli）來培養(yǎng)。

2.5.3　動物病毒的空斑實驗

動物病毒的培養(yǎng)可分為動物接種、雞胚接種和組織培養(yǎng)技術。其中組織培養(yǎng)技術受到廣泛的應用。

首先要進行動物細胞的培養(yǎng)，將動物病毒的敏感細胞按照一定的方法，經過培養(yǎng)后制成單層細胞的培養(yǎng)基。然后用采集的病毒樣品進行接種感染。經適當時間的孵育培養(yǎng)，結果在單層細胞的表面出現(xiàn)空斑。以出現(xiàn)的空斑數(shù)來判斷單位體積中所含的病毒數(shù)η_PFU。

所謂空斑是指原代或傳代單層細胞被病毒感染后，一個個細胞被病毒侵蝕而形成的空斑（或稱蝕斑）。一個空斑表示一個病毒。所以，通過病毒空斑單位的計數(shù)可以求出環(huán)境樣品中存在的病毒數(shù)量。

在病毒計數(shù)時，還常用到一個概念——病毒的滴度。所謂病毒的滴度是指能產生培養(yǎng)管中50% CPE（細胞病理效應）的最高病毒稀釋度（即最少的病毒量），稱為TCLD₅₀（組織培養(yǎng)感染劑量）。若是敏感動物，則用ID₅₀（使50%感染動物發(fā)生變化的感染劑量）或LD₅₀（使50%敏感動物死亡的致死劑量）來表示病毒的滴度。

2.5.4　噬菌體的培養(yǎng)和測定

由于細菌的培養(yǎng)相對比較簡單，所以噬菌體的培養(yǎng)相對也比較簡單。

1mL培養(yǎng)液中含有的活噬菌體的數(shù)目稱為噬菌體的效價。常用雙層瓊脂法來測定（滴定）噬菌體的效價，在實驗的前一天在滅菌的培養(yǎng)皿內倒入約10mL適合某種宿主細菌生長的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固成平板后置于一定溫度的培養(yǎng)箱內烘干平板上的水分，取2～3滴宿主菌（每毫升含10⁸個細菌）加入軟瓊脂培養(yǎng)基（融化并冷卻到45℃）中，再加入0.1mL噬菌體樣品，搖動混勻后全部倒入平板，使之鋪滿這個平板，凝固后，在一定溫度下倒置培養(yǎng)一定時間后，在平板上會出現(xiàn)噬菌斑，可以根據(jù)噬菌斑的數(shù)目計算出原液中噬菌體的數(shù)量（效價）。雙層瓊脂法見圖2-6。