實驗二 蠕蟲蟲卵培養及幼蟲分離技術

【實驗目的】

掌握蠕蟲蟲卵培養及幼蟲分離技術，認識常見線蟲幼蟲和吸蟲毛蚴等蠕蟲幼蟲的一般形態特征。

【實驗內容】

1．蠕蟲蟲卵培養技術。

2．毛蚴孵化技術。

3．幼蟲分離技術。

【材料與設備】

載玻片、蓋玻片、平皿、培養皿、鑷子、燒杯、放大鏡、漏斗、漏斗架、膠帽吸管、試管、玻璃管、玻璃棒、濾紙、紗布、脫脂棉、40～60目銅篩、三角燒杯、膠塞、長頸平底燒瓶、貝爾曼裝置（乳膠管兩端分別連接漏斗和小試管）、普通溫箱、光學顯微鏡等。

【操作與觀察】

一、蠕蟲蟲卵培養技術

有些蠕蟲蟲卵（如圓線目大部分線蟲）在形態上非常相似，難以鑒別，需要在外界一定溫度和濕度條件下進行第三期幼蟲的培養，然后根據幼蟲的形態特征進行種類鑒定，從而達到確診或進行科學研究的目的。

操作方法：取適量新鮮糞便置于培養皿（底部加一張濾紙）內，加水調成硬糊狀（如糞便稀則不必加水），塑成半球形，頂部略高出培養皿，加上皿蓋，使糞便與皿蓋接觸。然后置于25～30℃溫箱內培養，注意保持培養皿內濕度（保持濾紙潮濕狀態）。經7～15d后，多數蟲卵即可發育成為第三期幼蟲（圖2.1），并集中于皿蓋上的水滴中，將幼蟲吸出置于載玻片上，加蓋玻片用顯微鏡檢查。

二、毛蚴孵化技術

毛蚴孵化法是目前我國疫區檢查家畜血吸蟲的主要方法，也是國家考核達標驗收時規定的檢查方法。其原理是將含有血吸蟲卵的糞便在適宜的溫度條件下進行孵化，毛蚴孵出后，借著毛蚴向上、向光和向清的特性，進行觀察，做出診斷。該法具有樣本采集方便、方法成本低、檢查結果可靠等優點。

1．頂管孵化法（圖2.2）：取糞便50～100g，放入燒杯內用玻璃棒搗碎，加清水250～500mL，攪拌均勻，通過40～60目銅篩濾入另一燒杯內，加水至九成滿，靜置沉淀（每次約30min），之后將上清倒掉，再加清水攪拌均勻，沉淀，如此反復操作3～4次。然后將反復淘洗的糞渣倒入三角燒瓶，加入25℃的溫水，塞入中央插有玻璃管的膠塞，其中加水量以插入的玻璃管內露出一段水柱為準。最后放入25℃溫箱中孵化，孵化30min后開始用放大鏡觀察水柱內是否有毛蚴，如沒有，則每隔1h再觀察一次，直到發現毛蚴即可停止孵化。

2．棉析法（圖2.3）：取50～100g糞便，經上述方法反復淘洗、沉淀、換水后（不淘洗也可），將糞渣移入500mL的長頸平底燒瓶內，然后加入25℃的溫水，瓶口塞入薄層脫脂棉，加水至棉層上方10mL左右，最后置于25℃溫箱中孵化。孵化半小時后開始用放大鏡觀察棉層上面水中是否有毛蚴，如沒有，則每隔1h再觀察一次，直到發現毛蚴即可停止孵化。

樣品孵化后，經1、3、5h各觀察1次，檢查有無毛蚴的出現。毛蚴的觀察應在光線明亮處襯以黑色背景用肉眼觀察，必要時可借助放大鏡。毛蚴為淡白色、折光性強的菱形小蟲，多在距水面4cm的水內呈平行或斜行方向做直線運動。在顯微鏡下觀察時可見毛蚴呈前寬后窄的三角形，前端有一突起，周身有纖毛（圖2.4）。觀察時應注意與水生動物相區別。

三、幼蟲分離技術

幼蟲分離技術通常采用貝爾曼幼蟲分離技術，其原理是利用多數線蟲幼蟲受重力作用而不能移動，在一個沒有表面張力的水體內會逐漸下沉的特點。貝爾曼法可用于分離和濃集糞便、組織碎片和土壤樣品中的線蟲幼蟲。

操作方法：首先連接貝爾曼裝置（圖2.5），即用一根乳膠管兩端分別連接漏斗和小試管，然后置于漏斗架上。將糞便樣品（5～15g）搗碎，放置于一個濾茶器或包裹于粗棉布內，然后在漏斗里加入溫水。溫熱可以刺激幼蟲的活力，許多幼蟲就會來到糞團的表面并分離，向下流至彈簧夾處。在嚴重感染情況下，大約經一個小時后幼蟲便可移至水滴中。但是當只有少量幼蟲存在時，必須將貝爾曼裝置放置過夜再進行觀察。如果取1滴以上的水進行檢查，有必要對樣品進行離心，去上清，然后用吸管吸取一滴管底的沉淀物進行鏡檢。目前，許多學者對該技術進行了優化和改良，但基本原理相同。

線蟲幼蟲的形態見圖2.6。

【注意事項】

1．蟲卵培養法：在蟲卵培養過程中，應使培養皿內保持一定的濕度和溫度。

2．毛蚴孵化法：被檢糞便務必新鮮，不可觸地污染；洗糞容器不宜過小，免得增加換水次數，影響毛蚴早期孵出；換水時要一次倒完，避免沉淀物翻動，如有翻動，須等沉淀后再換水；孵化用水一定要清潔，自來水須放置過夜脫氯后使用；所有與糞便接觸過的用具，須清洗后再沸水燙泡，方可再用。另外，多畜檢查時，須做好登記，貼好標簽，避免混亂。

3．幼蟲分離法：凡是檢查組織器官材料，應盡量撕碎；但檢查糞便時，則將完整糞球放入，不必弄碎，以免糞渣落入小試管底部，鏡檢時不易觀察。溫水必須充滿整個小試管和乳膠管，并使被檢材料浸泡其中（使水不致流出為止），中間不得有氣泡或空隙。為了靜態觀察幼蟲形態構造，可用酒精燈加熱或滴入少量碘液，將載玻片上的幼蟲殺死。

【思考題】

1．蠕蟲蟲卵培養技術可用于什么？

2．幼蟲分離技術可用于什么？其原理是什么？

3．毛蚴孵化法常用于哪種寄生蟲病的診斷，其原理是什么？

【實驗報告要求】

1．記錄各檢查技術的糞檢結果。

2．簡要敘述各項技術的主要原理和方法。