實驗三 蠕蟲學蟲卵計數及測微技術

【實驗目的】

掌握蠕蟲學常用的蟲卵計數及測微技術。

【實驗內容】

1．麥克馬斯特氏法。

2．斯陶爾氏法。

3．測微法。

【材料與設備】

載玻片、蓋玻片、鑷子、塑料杯或紙杯、膠帽吸管、玻璃棒、玻璃珠、量筒、燒瓶、糞篩、麥克馬斯特氏計數板、顯微鏡測微器、光學顯微鏡、飽和食鹽水、0.1mol/L（或4%）NaOH溶液、家畜新鮮糞便。

【操作與觀察】

一、麥克馬斯特氏法

麥克馬斯特氏計數板由兩片載玻片組成，上面的較下面稍窄；窄的玻片上有兩個1cm×1cm的正方形刻度區，每個正方形又平分為6個長方格。兩玻片間墊有幾個1.5mm厚的玻璃條。這樣就形成了兩個0.15mL的計數室（圖3.1）。

操作方法：取2g糞便放入裝有玻璃珠的燒瓶內，加入58mL飽和食鹽水振蕩混勻，用糞篩過濾，濾液搖晃混勻后立即吸出少量滴入計數室內，靜置于顯微鏡臺上，幾分鐘后用低倍顯微鏡計數兩個計數室內的蟲卵，取平均值，再乘以200，可得到每克糞便蟲卵數（EPG）。

二、斯陶爾氏法

向特制的燒瓶（瓶頸部有56mL和60mL兩個刻度）或其他標好56mL和60mL刻度的試管或三角瓶內加入0.1mol/L（或4%）NaOH溶液至56mL處，加入搗碎的糞便至液面達60mL處。加入十多個玻璃珠振蕩混勻糞液，立即用吸管吸取0.15mL于載玻片上，蓋以不小于22～40mm的蓋玻片，于顯微鏡下進行蟲卵計數（若沒有大蓋玻片，可以用若干小蓋玻片代替）。計數蟲卵數乘以100可得到1mL糞便的蟲卵數。因為糞便性狀影響估算結果，所以1mL的蟲卵數再乘以糞便性狀系數即為每克糞便中所含的蟲卵數。半成形糞便乘以1.5，軟濕糞便乘以2，粥樣糞便乘以3，水樣糞便乘以4。

目前，以上兩種方法為獸醫蠕蟲學蟲卵定量計數最常用的方法，操作簡便，設備要求簡單，適合臨床推斷家畜體內某種寄生蟲的數量和檢查藥物驅蟲效果。麥克馬斯特氏法對糞便稀釋度大，被檢容積小，容易造成漏檢，且只適用于可被飽和鹽水浮起的各種蟲卵計數。各種蠕蟲卵的比重見表3.1。

斯陶爾氏法計數較慢，較為耗時。該方法在每克糞便中蟲卵數高于1000個時準確度高，低于500個時誤差較大。

三、測微法

顯微鏡測微器由目鏡測微尺和物鏡測微尺組成。目鏡測微尺為可放在目鏡里的圓形小玻璃片，中央刻有100等份的小格（圖3.2），這些小格在鏡下沒有絕對長度的意義，是隨著目鏡和物鏡倍數的不同及鏡筒的長短而變化的。物鏡測微尺為特制的載玻片，其中央有一黑圈（或是一個圓玻璃片，上有黑圈），圈的中間有一長為1mm的橫線，被平分為100格，每格長度為0.01mm（圖3.3），這是絕對長度。

操作方法：將目鏡測微尺放于目鏡內，物鏡測微尺放于載物臺上；先用低倍鏡觀察，調節焦距，使目鏡測微尺和物鏡測微尺的零點對齊，再尋找兩者較遠端的另一重合線，算出目鏡測微尺的幾格相當于物鏡測微尺的幾格，從而計算出目鏡測微尺上每格的長度。取下物鏡測微尺，換上需要測量的蟲卵玻片標本，一般測量蟲卵的最長和最寬處（圖3.4），圓形蟲卵則是測量直徑。

為了方便計算，可將目鏡測微尺在固定顯微鏡和固定倍數物鏡下的0～9格長度算好，記錄下來。如沒有物鏡測微尺，可用血球計數板來代替使用。

【注意事項】

1．蟲卵計數時，所取糞便要求新鮮，不能有土和草等雜質；吸取糞液時必須混勻并在一定的深度吸取。鏡檢時，不能有重復和遺漏。

2．為了減少每晝夜寄生蟲排卵不均衡所造成的蟲卵計數不準確，最好在每日的不同時間檢查3次，連續檢查3d，然后取其平均值。每日排卵量為每克糞便蟲卵數乘以24h內糞便總量所得值，將該值除以已知成蟲每日排卵數，即可得出雌蟲的大約數量。

3．蟲卵測量時，某個顯微鏡測出的目鏡測微尺每格的長度只適用于該顯微鏡一定的目鏡倍數和物鏡倍數。使用油鏡時，必須在物鏡測微尺上加蓋玻片后再測量，以免損壞刻度線。

【思考題】

1．每克糞便蟲卵數量是否反映宿主寄生蟲感染程度？

2．在10倍目鏡、40倍物鏡、鏡筒不抽出的情況下，目鏡測微尺的44格相當于鏡臺測微尺的15格（即150μm），則該條件下目鏡測微尺的每格長度為多少？此時，取下物鏡測微尺，測量具體蟲卵，如果測得其長度為24格，其蟲卵長度為多少？

【實驗報告要求】

1．采用兩種蟲卵計數方法計數同一份糞樣并記錄結果。

2．測量2～3種蟲卵的大小。