第4章　蛋白質的共價結構

4.1　復習筆記

一、蛋白質通論

1蛋白質的化學組成和分類

（1）蛋白質的組成

表4-1　蛋白質中各元素的組成百分比

①蛋白質是一類重要的生物大分子，主要含有碳、氫、氧、氮和少量的硫，有些蛋白質還含有一些其他元素（表4-1）。

②凱氏定氮法是根據蛋白質的平均含氮量為16%，測定樣品中的含氮量即可推算出樣品中的蛋白質含量。

蛋白質含量＝蛋白氮×6.25

其中6.25即16%的倒數，為1g氮所代表的蛋白質量（克數）。

（2）蛋白質的分類

①按組成將蛋白質分為單純蛋白質和綴合蛋白質。

②按形狀和溶解度可分為球狀蛋白質、纖維狀蛋白質和膜蛋白。

③按功能可分為酶、運輸蛋白、營養和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運動蛋白、結構蛋白、防御蛋白等。

2蛋白質分子的形狀和特點（表4-2）

表4-2　蛋白質的形狀及特點

3蛋白質功能的多樣性（表4-3）

表4-3　蛋白質的主要功能及實例

二、肽

1肽和肽鍵的結構

（1）肽

肽又稱肽鏈，是由兩個或兩個以上的氨基酸通過肽鍵共價鍵連接形成的線性聚合物。根據肽中所含的氨基酸個數可將肽分為二肽、三肽、四肽、五肽等，最簡單的肽是二肽。

（2）肽鍵

肽鍵是指一個氨基酸的α-羧基和另一個氨基酸的α-氨基脫水縮合形成的酰胺鍵（—CO—NH—）。由于酰胺氮上的孤電子離域與羰基碳軌道重疊，因此在酰胺氮與羰基氧之間發生共振相互作用。肽鍵共振產生以下幾方面的重要結果：

①限制繞肽鍵的自由旋轉；

②組成肽基的4個原子和2個相鄰的C_α傾向共平面，形成肽平面；

③C-N鍵具有部分雙鏈性質，C＝O鍵具有部分單鏈性質；

④肽鍵具有永久偶極；

⑤肽鍵具有反式構型。

（3）二硫鍵

二硫鍵又稱二硫橋，是指在蛋白質和多肽分子之間由兩個半胱氨酸殘基的側鏈之間形成的鍵，它可以使兩條單獨的肽鏈共價交聯起來或使一條鏈的某一部分形成環，在蛋白質的三維結構中起重要作用。

2肽的物理和化學性質

（1）肽的物理性質

①短肽是離子晶格，在水溶液中以偶極離子；

②肽具有旋光性，一般短肽的旋光度約等于組成該肽中各個氨基酸的旋光度的總和；

③肽的酸堿性質主要決定于肽鍵中的游離末端α-NH₂、α-COOH和側鏈R基上的可解離基團。

（2）肽的化學性質

①茚三酮反應

肽的N端氨基酸殘基和茚三酮也能發生定量反應，生成藍紫色，反應并不放出CO₂。這一反應廣泛地應用于肽的定性和定量測定。

②雙縮脲反應

雙縮脲反應是指肽與堿性CuSO₄反應，生成紫紅色或藍紫色復合物的反應，是肽和蛋白質所特有一個顏色反應。反應顏色的深淺與肽或蛋白質的含量成正比，利用這個反應借助分光光度計可以測定蛋白質的含量。

3還原型谷胱甘肽

（1）定義

動植物細胞中都含有一種重要的三肽即還原型谷胱甘肽，全稱γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，它含有游離的SH基，常用GSH來表示。根據其性質可分為氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽。

（2）作用

①還原型谷胱甘肽在紅細胞中作為巰基緩沖劑存在，維持血紅蛋白和紅細胞其他蛋白質的半胱氨酸殘基處于還原態；

②谷胱甘肽可參與細胞內的氧化還原反應保護細胞，是一些酶的輔酶組成成分。

三、蛋白質一級結構的測定

1蛋白質測序的策略

（1）概述

蛋白質的一級結構是指氨基酸殘基的組成、數目以及排列順序。測定蛋白質的一級結構，要求樣品必須是均一的，純度應在97%以上，同時必須知道它的相對分子質量。

（2）氨基酸測序步驟

表4-4　氨基酸測序的步驟及過程

2N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定

表4-5　蛋白質中氨基酸鑒定常用的方法

圖4-1　肽鏈分析中酶解法常用的酶及其專一性

3肽段氨基酸序列的測定

（1）Edman化學降解法

Edman化學降解法又稱苯異硫氰酸酯（PITC）法，用于N-末端基分析。反應時Edman降解試劑（PITC）與多肽鏈的游離氨基作用，分三步進行。

①偶聯反應：由于PITC只能與未質子化的-NH₂起作用，所以反應在弱堿性介質中進行。

②環化斷裂反應：在無水強酸介質中，第一步反應形成的PTC-肽最靠近PTC基的肽鍵將發生斷裂，同時PTC-氨基酸殘基環化成噻唑啉酮苯胺衍生物。反應必須在無水條件下進行，否則其他肽鍵也將被水解。

③轉化反應：將第二步中生成物在酸性水溶液中將它轉變為PTH-氨基酸。

（2）酶降解法

利用肽鏈外切酶（外肽酶），如氨肽酶和羧肽酶分別從肽鏈的N-末端和C-末端逐個地向里切，以此來確定肽的氨基酸序列。

（3）質譜法（MS）

因為MS測序要求樣品是揮發性的，蛋白質（以及核酸和糖類）這類生物大分子的揮發性很低，且加熱易被分解，故衍生出電噴射電離串聯質譜法或氣譜-質譜聯用法。MS靈敏度高、所需樣品少、測定速度快。

（4）根據核苷酸序列推定法

根據中心法則來進行核苷酸的序列推定。

4肽段在多肽鏈中次序的決定

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序，即重疊肽拼湊法。

5二硫鍵位置的確定

（1）胃蛋白酶處理蛋白質，得到含有二硫鍵或者二硫橋的較小肽段；

（2）經對角線電泳分離各肽段：

①用過甲酸斷開二硫鍵，含有-S-S-的肽段帶電性質發生變化，轉向90℃二次電泳，二硫鍵的肽段遷移率發生變化；

②同其他方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。

四、蛋白質的氨基酸序列與生物功能

1同源蛋白質物種差異與生物進化

（1）同源蛋白質

同源蛋白質是指在不同物種中行使相同或相似功能的蛋白質。同源蛋白質一般具有幾乎相同長度的多肽鏈，并且它們的氨基酸序列與提取它們物種的親緣關系具有同一性。

①不變殘基：對蛋白質生物功能所必需的氨基酸殘基在進化過程幾乎保持不變，稱為不變殘基。

②可變殘基：是指對蛋白質功能不太重要的氨基酸殘基在進化過程中可能發生改變，稱為可變殘基。

（2）細胞色素c

細胞色素c存在于所有真核生物的線粒體中，是一種含血紅素的電子轉運蛋白，含有100多個氨基酸殘基，其中28個是不變殘基。細胞色素c的氨基酸序列資料可用來核對各個物種之間的分類學關系以及繪制系統進化樹，細胞色素c序列的研究為同源性提供了最好的證據。

2同源蛋白質具有共同的進化起源

（1）同源蛋白質的氨基酸序列分析揭示了這些蛋白質具有共同的進化祖先，但進化的時間和進程抹去了它們有共同祖先的大部分證據；

（2）在進化途徑中，具有同源關系的的蛋白質基因的隨機突變導致一級結構方面氨基酸取代和分歧或趨異事件的進化順序；

（3）基因的突變和復制是創造多樣性的重要進化力，因此很多同源性蛋白質顯示不同的功能；

（4）代表物質有氧合血紅素蛋白質、絲氨酸蛋白酶類以及一些功能差異很大的蛋白質。

五、肽和蛋白質的人工合成

1肽的人工合成

（1）肽的人工合成類型

2胰島素的人工合成

我國科學家首次合成牛胰島素的主要途徑是先分別合成A鏈二十一肽和B鏈三十肽，再將A、B兩條肽鏈經還原、氧化連接成牛胰島素。

（1）A鏈合成是先分別獲得N端九肽和C端十二肽，然后脫去十二肽N端的保護基，與九肽以疊氮法縮合成帶保護基的A鏈。

（2）B鏈的合成采取8＋22的途徑，為了避免大肽連接時發生消凝，特意在B₈、B₂₀、B₂₃的甘氨酸殘基處分段，合成了以甘氨酸為羧端的肽段。在不得不用其他氨基酸為C末端時，盡量用疊氮法或者活化酯法接肽以保證光學純度。

（3）在A、B鏈的基礎上進行全合成。帶保護基的二十一肽和三十肽衍生物分別用Na-液NH3處理后，再用連四硫酸鈉和亞硫酸鈉進行S-磺酸化，經初步純化后得到二十一肽和三卜肽的SSO₃-衍生物。A鏈和8鏈按l.2：1.0的分子比混合，以摩爾的巰基乙酸還原，然后在空氣中氧化，再經提純提純后得到產物。

3固相肽合成

（1）在固相合成中，肽鏈的逐步延躍是在不溶性聚苯乙烯樹脂小珠上進行的，這是為了反應后可通過簡單的過濾回收被延長的產物，用于下一步合成；

（2）固相肽合成的簡略步驟為掛接、去保護、中和、縮合、斷裂與去保護，合成方向為C端→N端。