第4章　蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)

4.1　復(fù)習(xí)筆記

一、蛋白質(zhì)通論

1蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類

（1）蛋白質(zhì)的組成

表4-1　蛋白質(zhì)中各元素的組成百分比

①蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子，主要含有碳、氫、氧、氮和少量的硫，有些蛋白質(zhì)還含有一些其他元素（表4-1）。

②凱氏定氮法是根據(jù)蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，測定樣品中的含氮量即可推算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。

蛋白質(zhì)含量＝蛋白氮×6.25

其中6.25即16%的倒數(shù)，為1g氮所代表的蛋白質(zhì)量（克數(shù)）。

（2）蛋白質(zhì)的分類

①按組成將蛋白質(zhì)分為單純蛋白質(zhì)和綴合蛋白質(zhì)。

②按形狀和溶解度可分為球狀蛋白質(zhì)、纖維狀蛋白質(zhì)和膜蛋白。

③按功能可分為酶、運輸?shù)鞍住I養(yǎng)和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運動蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、防御蛋白等。

2蛋白質(zhì)分子的形狀和特點（表4-2）

表4-2　蛋白質(zhì)的形狀及特點

3蛋白質(zhì)功能的多樣性（表4-3）

表4-3　蛋白質(zhì)的主要功能及實例

二、肽

1肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)

（1）肽

肽又稱肽鏈，是由兩個或兩個以上的氨基酸通過肽鍵共價鍵連接形成的線性聚合物。根據(jù)肽中所含的氨基酸個數(shù)可將肽分為二肽、三肽、四肽、五肽等，最簡單的肽是二肽。

（2）肽鍵

肽鍵是指一個氨基酸的α-羧基和另一個氨基酸的α-氨基脫水縮合形成的酰胺鍵（—CO—NH—）。由于酰胺氮上的孤電子離域與羰基碳軌道重疊，因此在酰胺氮與羰基氧之間發(fā)生共振相互作用。肽鍵共振產(chǎn)生以下幾方面的重要結(jié)果：

①限制繞肽鍵的自由旋轉(zhuǎn)；

②組成肽基的4個原子和2個相鄰的C_α傾向共平面，形成肽平面；

③C-N鍵具有部分雙鏈性質(zhì)，C＝O鍵具有部分單鏈性質(zhì)；

④肽鍵具有永久偶極；

⑤肽鍵具有反式構(gòu)型。

（3）二硫鍵

二硫鍵又稱二硫橋，是指在蛋白質(zhì)和多肽分子之間由兩個半胱氨酸殘基的側(cè)鏈之間形成的鍵，它可以使兩條單獨的肽鏈共價交聯(lián)起來或使一條鏈的某一部分形成環(huán)，在蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起重要作用。

2肽的物理和化學(xué)性質(zhì)

（1）肽的物理性質(zhì)

①短肽是離子晶格，在水溶液中以偶極離子；

②肽具有旋光性，一般短肽的旋光度約等于組成該肽中各個氨基酸的旋光度的總和；

③肽的酸堿性質(zhì)主要決定于肽鍵中的游離末端α-NH₂、α-COOH和側(cè)鏈R基上的可解離基團(tuán)。

（2）肽的化學(xué)性質(zhì)

①茚三酮反應(yīng)

肽的N端氨基酸殘基和茚三酮也能發(fā)生定量反應(yīng)，生成藍(lán)紫色，反應(yīng)并不放出CO₂。這一反應(yīng)廣泛地應(yīng)用于肽的定性和定量測定。

②雙縮脲反應(yīng)

雙縮脲反應(yīng)是指肽與堿性CuSO₄反應(yīng)，生成紫紅色或藍(lán)紫色復(fù)合物的反應(yīng)，是肽和蛋白質(zhì)所特有一個顏色反應(yīng)。反應(yīng)顏色的深淺與肽或蛋白質(zhì)的含量成正比，利用這個反應(yīng)借助分光光度計可以測定蛋白質(zhì)的含量。

3還原型谷胱甘肽

（1）定義

動植物細(xì)胞中都含有一種重要的三肽即還原型谷胱甘肽，全稱γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，它含有游離的SH基，常用GSH來表示。根據(jù)其性質(zhì)可分為氧化型谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽。

（2）作用

①還原型谷胱甘肽在紅細(xì)胞中作為巰基緩沖劑存在，維持血紅蛋白和紅細(xì)胞其他蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基處于還原態(tài)；

②谷胱甘肽可參與細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)保護(hù)細(xì)胞，是一些酶的輔酶組成成分。

三、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定

1蛋白質(zhì)測序的策略

（1）概述

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指氨基酸殘基的組成、數(shù)目以及排列順序。測定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，要求樣品必須是均一的，純度應(yīng)在97%以上，同時必須知道它的相對分子質(zhì)量。

（2）氨基酸測序步驟

表4-4　氨基酸測序的步驟及過程

2N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定

表4-5　蛋白質(zhì)中氨基酸鑒定常用的方法

圖4-1　肽鏈分析中酶解法常用的酶及其專一性

3肽段氨基酸序列的測定

（1）Edman化學(xué)降解法

Edman化學(xué)降解法又稱苯異硫氰酸酯（PITC）法，用于N-末端基分析。反應(yīng)時Edman降解試劑（PITC）與多肽鏈的游離氨基作用，分三步進(jìn)行。

①偶聯(lián)反應(yīng)：由于PITC只能與未質(zhì)子化的-NH₂起作用，所以反應(yīng)在弱堿性介質(zhì)中進(jìn)行。

②環(huán)化斷裂反應(yīng)：在無水強(qiáng)酸介質(zhì)中，第一步反應(yīng)形成的PTC-肽最靠近PTC基的肽鍵將發(fā)生斷裂，同時PTC-氨基酸殘基環(huán)化成噻唑啉酮苯胺衍生物。反應(yīng)必須在無水條件下進(jìn)行，否則其他肽鍵也將被水解。

③轉(zhuǎn)化反應(yīng)：將第二步中生成物在酸性水溶液中將它轉(zhuǎn)變?yōu)镻TH-氨基酸。

（2）酶降解法

利用肽鏈外切酶（外肽酶），如氨肽酶和羧肽酶分別從肽鏈的N-末端和C-末端逐個地向里切，以此來確定肽的氨基酸序列。

（3）質(zhì)譜法（MS）

因為MS測序要求樣品是揮發(fā)性的，蛋白質(zhì)（以及核酸和糖類）這類生物大分子的揮發(fā)性很低，且加熱易被分解，故衍生出電噴射電離串聯(lián)質(zhì)譜法或氣譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。MS靈敏度高、所需樣品少、測定速度快。

（4）根據(jù)核苷酸序列推定法

根據(jù)中心法則來進(jìn)行核苷酸的序列推定。

4肽段在多肽鏈中次序的決定

利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序，即重疊肽拼湊法。

5二硫鍵位置的確定

（1）胃蛋白酶處理蛋白質(zhì)，得到含有二硫鍵或者二硫橋的較小肽段；

（2）經(jīng)對角線電泳分離各肽段：

①用過甲酸斷開二硫鍵，含有-S-S-的肽段帶電性質(zhì)發(fā)生變化，轉(zhuǎn)向90℃二次電泳，二硫鍵的肽段遷移率發(fā)生變化；

②同其他方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。

四、蛋白質(zhì)的氨基酸序列與生物功能

1同源蛋白質(zhì)物種差異與生物進(jìn)化

（1）同源蛋白質(zhì)

同源蛋白質(zhì)是指在不同物種中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。同源蛋白質(zhì)一般具有幾乎相同長度的多肽鏈，并且它們的氨基酸序列與提取它們物種的親緣關(guān)系具有同一性。

①不變殘基：對蛋白質(zhì)生物功能所必需的氨基酸殘基在進(jìn)化過程幾乎保持不變，稱為不變殘基。

②可變殘基：是指對蛋白質(zhì)功能不太重要的氨基酸殘基在進(jìn)化過程中可能發(fā)生改變，稱為可變殘基。

（2）細(xì)胞色素c

細(xì)胞色素c存在于所有真核生物的線粒體中，是一種含血紅素的電子轉(zhuǎn)運蛋白，含有100多個氨基酸殘基，其中28個是不變殘基。細(xì)胞色素c的氨基酸序列資料可用來核對各個物種之間的分類學(xué)關(guān)系以及繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，細(xì)胞色素c序列的研究為同源性提供了最好的證據(jù)。

2同源蛋白質(zhì)具有共同的進(jìn)化起源

（1）同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析揭示了這些蛋白質(zhì)具有共同的進(jìn)化祖先，但進(jìn)化的時間和進(jìn)程抹去了它們有共同祖先的大部分證據(jù)；

（2）在進(jìn)化途徑中，具有同源關(guān)系的的蛋白質(zhì)基因的隨機(jī)突變導(dǎo)致一級結(jié)構(gòu)方面氨基酸取代和分歧或趨異事件的進(jìn)化順序；

（3）基因的突變和復(fù)制是創(chuàng)造多樣性的重要進(jìn)化力，因此很多同源性蛋白質(zhì)顯示不同的功能；

（4）代表物質(zhì)有氧合血紅素蛋白質(zhì)、絲氨酸蛋白酶類以及一些功能差異很大的蛋白質(zhì)。

五、肽和蛋白質(zhì)的人工合成

1肽的人工合成

（1）肽的人工合成類型

2胰島素的人工合成

我國科學(xué)家首次合成牛胰島素的主要途徑是先分別合成A鏈二十一肽和B鏈三十肽，再將A、B兩條肽鏈經(jīng)還原、氧化連接成牛胰島素。

（1）A鏈合成是先分別獲得N端九肽和C端十二肽，然后脫去十二肽N端的保護(hù)基，與九肽以疊氮法縮合成帶保護(hù)基的A鏈。

（2）B鏈的合成采取8＋22的途徑，為了避免大肽連接時發(fā)生消凝，特意在B₈、B₂₀、B₂₃的甘氨酸殘基處分段，合成了以甘氨酸為羧端的肽段。在不得不用其他氨基酸為C末端時，盡量用疊氮法或者活化酯法接肽以保證光學(xué)純度。

（3）在A、B鏈的基礎(chǔ)上進(jìn)行全合成。帶保護(hù)基的二十一肽和三十肽衍生物分別用Na-液NH3處理后，再用連四硫酸鈉和亞硫酸鈉進(jìn)行S-磺酸化，經(jīng)初步純化后得到二十一肽和三卜肽的SSO₃-衍生物。A鏈和8鏈按l.2：1.0的分子比混合，以摩爾的巰基乙酸還原，然后在空氣中氧化，再經(jīng)提純提純后得到產(chǎn)物。

3固相肽合成

（1）在固相合成中，肽鏈的逐步延躍是在不溶性聚苯乙烯樹脂小珠上進(jìn)行的，這是為了反應(yīng)后可通過簡單的過濾回收被延長的產(chǎn)物，用于下一步合成；

（2）固相肽合成的簡略步驟為掛接、去保護(hù)、中和、縮合、斷裂與去保護(hù)，合成方向為C端→N端。